研究背景微小核糖核酸(microRNAs,miRNAs)是一类由约21—25个核苷酸组成的单链非编码小核糖核酸(RNA),广泛存在于植物动物和人基因组中,进化上高度保守,通过与靶mRNA3’非翻译区(3-untranslated regions,3’UTR),完全或者不完全互补配对的方式引起靶mRNA的降解或翻译抑制,从而实现在转录后水平对靶mRNA表达的调控作用,广泛参与了生物体的生长发育及许多生理及病理过程。目前,许多研究发现,在人体的细胞外体液中,比如血浆、血清、尿液、唾液、脑脊液、腹水、胸水等中均可检测到miRNAs的存在。且已有研究表明血浆或血清中的miRNAs的性质比较稳定,它们一方面可以对抗核糖核酸酶的消化,另一方面还不受酸碱度变化、温度变化及放置时间等恶劣环境的影响。而且大部分miRNAs的序列是高度保守的。鉴于外周循环中miRNAs的稳定性、保守性,其有潜力成为比一般蛋白更为有效的生物学标记物。MiRNAs的发现成为生物学研究的一个热点。高血压脑出血(hypertensive intracerebral hemorrhage, HICH)是以高血压为主要病因引起的原发性非外伤性脑实质内出血。在我国,随着人口老龄化的发展,HICH的发病率逐年上升。由于HICH起病急骤,且出血部位多位于脑深部,单纯外科手术难以达到满意效果,导致其具有高致残率及高致死率的特点,给个人、家庭及社会带来沉重的负担。因此,如何能够有效的预测HICH的发生成为目前的研究热点,这需要我们能够寻找到有效的分子生物学标记物,对其在HICH的发病机制、预后判断和靶向治疗中可能发挥的作用进行深入的研究和探讨。目前,越来越多的研究表明不同疾病其外周循环(血清或血浆)中miRNAs有独特的表达改变,比如肿瘤、冠状动脉粥样硬化性心脏病、糖尿病等,并有可能作为诊断、判断预后、疗效评估的非侵入性生物学标志。关于脑梗塞与miRNAs的研究亦取得了一些成就,发现了一些miRNAs可以作为区别不同脑梗塞亚型的生物学标志,也研究了一些miRNAs在脑梗塞中的作用机制。但是在HICH中,国外尚无相关研究报道。鉴于以上理论及实验基础,本研究将对HICH患者进行血浆miRNAs表达谱的分析,并挑选几个差异表达最明显的miRNAs进行初步验证,进一步采用生物信息学分析预测可能的靶基因推测miRNAs可能的作用机制。本研究将筛选出的差异表达的特异性miRNAs作为HICH高危人群中筛选的早期分子标记物具有非常重的意义,同时为后续的发病机制及靶向治疗的研究提供实验基础。第一章HICH患者外周循环(血浆)microRNAs表达谱的分析目的：研究高血压脑出血(hypertensive intracerebral hemorrhage, HICH)患者血浆与高血压患者血浆中差异性miRNAs表达谱,筛选与HICH相关的miRNAs。实验方法：1、研究对象的确定及研究标本的收集及处理选取3名高血压脑出血患者与3名高血压患者作为研究对象。于清晨空腹抽取每位患者外周静脉血6ml,所有标本均使用医用EDTA抗凝管收集。所有标本均在2小时之内进行血浆分离。分离好的血浆置于-80℃保存备用。2、血浆RNA的提取及质量检测采用血浆/血清外泌体RNA提取试剂盒提取总RNA。总RNA的质量检测采用基于SYBR Green I的荧光定量PCR方法,以has-miR-16和has-miR-192作为质检指标。3、miRNAs芯片检测采用u ParaflorTM micoarray芯片筛选高血压脑出血患者与高血压患者血浆中差异表达的miRNAs。4、统计学分析本实验的计量资料的实验数据以均数±标准差(χ±s)来表示。计量资料的组间比较采用两独立样本的t检验,计数资料的组间比较采用χ2检验。采用SPSS13.0统计软件进行系统分析。定义P<0.05为有统计学差异。结果：1、血浆RNA的质量检测运用质检指标hsa-miR-16和hsa-miR-192,根据文献报道所建议的指标Ct值范围(hsa-miR-16的参考Ct值范围为16-22,hsa-miR-192的参考Ct值范围为25-30),判定此次提取的血浆RNA除了40号样品外,其余均合格,可进入下游芯片实验。40号样品提取的RNA中指标hsa-miR-16和hsa-miR-192, Ct值偏大,均超出文献规定的Ct值范围,且hsa-miR-192指标的溶解曲线出现双峰,导致该样品暂停下游实验。因40号样品为1例对照组样品,因此实际进入下游miRNAs芯片检测的总共有5个样本,即HICH组3例样本,对照组2例样本。2、基因芯片的结果对3例高血压脑出血组与2例高血压对照组血浆miRNAs表达谱进行比较,共筛选出9个差异性表达的miRNAs,其中表达上调的miRNAs有3个(hsa-miR-5787、hsa-miR-149-3p、hsa-miR-6786-5p),表达下调的miRNAs有6个(hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-30c-5p、hsa-miR-5195-3p、hsa-miR-22-3p、 hsa-miR-342-3p、及hsa-miR-15b-5p)。无上调超过2倍的miRNAs,但hsa-miR-5787上调倍数最大；下调大于或等于2倍的hsa-miRNAs有3个：hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-30c-5p、hsa-miR-5195-3p,以has-miR-29a-3p下调最为明显。结论：初步建立起高血压脑出血患者血浆中miRNAs表达谱,相对于高血压患者,3个miRNAs在高血压脑出血患者血浆中表达上调,6个miRNAs表达下调。这些差异表达的miRNAs可能与高血压脑出血的发病相关。第二章MicroRNAs基因芯片结果验证及生物信息学分析目的：验证高血压脑出血患者血浆中差异性表达的miRNAs,并预测其在发病机制中可能所起的作用。实验方法：1、研究对象的确定及研究标本的收集及处理选取20名高血压脑出血患者与15名高血压患者作为研究对象。于清晨空腹抽取每位患者外周静脉血6ml,使用医用EDTA抗凝管收集。所有标本均在2小时之内进行血浆分离。分离好的血浆置于-80。C保存备用。2、血浆RNA的提取及质量检测采用基于TRIzol法的RNA抽提技术,获取血浆总RNA。使用紫外吸收测定法及变性琼脂糖凝胶电泳法对提取的RNA进行质量检测。3、RT-PCR利用RT-PCR技术对筛选出的3个下调倍数最大的miRNAs: hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-30c-5p、hsa-miR-5195-3p进行验证。4、生物信息学分析对筛选出的3个下调倍数最大的miRNAs:hsa-miR-29a-3p、 hsa-miR-30c-5p、hsa-miR-5195-3p进行靶基因预测。应用互联网miRNAs靶基因预测软件Pictar (http://pictar.mdc-berlin.de/)、MiRanda(http:///www.microma.org)、Targetscan (http://www.targetscan.org/)在线服务站点,输出差异表达miRNAs的预测靶基因。为了减少假阳性率,我们取至少2个软件预测到的基因作为靶基因。5、统计学分析本实验的计量资料的实验数据以均数±标准差(χs)来表示。计量资料的组间比较采用两独立样本的t检验,计数资料的组间比较采用χ2检验。采用SPSS13.0统计软件进行系统分析。定义P<0.05为有统计学差异。结果：1、RNA质量检测结果本部分实验所提取的RNA样品,用紫外分光光度计测其各自的A260和A280,得到所有样品RNA的A260/A280的值的范围均在1.8-2.1之间。变性琼腊糖凝胶电泳结果提示：所提取RNA样品的28S：18S均接近2：1,且电泳条带较清晰,无明显弥散拖尾现象及杂条带,说明所提取的RNA完整性较好,可进入下游RT-PCR实验。2、RT-PCR结果为了验证第一步基因芯片的结果,我们挑选了3个下调倍数最大的miRNAs:hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-30c-5p、hsa-miR-5195-3p,在20例HICH患者和15例对照者中进行RT-PCR验证,以hsa-miR-93作为内参基因。相对于高血压患者,hsa-miR-29a-3p下调倍数仍最大,超过2倍,且比芯片下调倍数明显；hsa-miR-30c-5p和hsa-miR-5195-3p仍呈现表达下调,但下调倍数不及芯片下调倍数明显,但是下调趋势与芯片结果相同。3、生物信息学分析结果我们应用互联网miRNAs靶基因预测软件(Pictar、MiRanda、Targetscan)在线服务站点,对显著下调的niRNAs:hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-30c-5p、 hsa-miR-5195-3p进行靶基因预测。为了减少假阳性率,我们取至少2个软件预测到的基因作为靶基因。hsa-miR-29a-3p共预测到103个靶基因,hsa-miR-30c-5p预测到103个靶基因。由于目前对hsa-miR-5195-3p研究较少,尚无hsa-miR-5195-3p靶基因的相关信息。其中,我们注意到,hsa-miR-29a-3p预测的靶基因中包括COL1A2。对靶基因分析后发现,靶基因作用广泛,涉及蛋白质的合成及修饰、转录过程的调节、炎性反应、血管生成、调节信号转导通路、以及细胞的凋亡、分化、增殖等。结论：1、RT-PCR结果与基因芯片的结果具有一致趋势,说明基因芯片结果真实可靠。2、实验筛选出的差异表达的miRNAs (hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-30c-5p、 hsa-miR-5195-3p),它们可以作为HICH的分子生物标志物,也可能可以作为高血压患者中易发生HICH的高危人群的筛查指标,且有可能参与了HICH的发病机制。3、hsa-miR-29a-3p的靶基因之一为COL1A2,与Ⅰ型胶原蛋白合成相关。hsa-miR-29a-3p可能通过对COL1A2的调控,减弱了血管壁的弹性及抗压能力,从而参与了高血压脑出血的发生发展过程。hsa-miR-30c-5p可能通过对靶基因的DLL4的调控,从而影响血管的形成及发展,进而参与HICH的发生。hsa-miR-5195-3p的作用机制需要进一步探讨。