【摘 要】
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目的:放射治疗引起唾液腺功能障碍等并发症。线粒体是电离辐射损伤细胞的重要靶点,导致正常细胞产生过量的活性氧自由基,引起细胞氧化应激反应和细胞内线粒体稳态失衡。甘草甜素（glycyrrhizin,GL）,是从中药甘草中提取的天然物质,在多种组织细胞被证实能减轻细胞氧化应激。本实验在颌下腺C6细胞系和电离辐射动物模型中,探讨甘草甜素对电离辐射后颌下腺及其线粒体的防护作用及其分子机制。材料和方法:使用X
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目的:放射治疗引起唾液腺功能障碍等并发症。线粒体是电离辐射损伤细胞的重要靶点,导致正常细胞产生过量的活性氧自由基,引起细胞氧化应激反应和细胞内线粒体稳态失衡。甘草甜素（glycyrrhizin,GL）,是从中药甘草中提取的天然物质,在多种组织细胞被证实能减轻细胞氧化应激。本实验在颌下腺C6细胞系和电离辐射动物模型中,探讨甘草甜素对电离辐射后颌下腺及其线粒体的防护作用及其分子机制。材料和方法:使用X线辐射大鼠颌下腺SMG-C6细胞系和Wistar大鼠后建立体内实验模型并分组（大鼠共40只,每组10只）:空白对照组、单纯甘草甜素组（X线辐射前1小时采用腹腔注射甘草甜素4 mg/kg及体外实验用甘草甜素10μM在X线辐射前24小时孵育SMG-C6细胞）、单纯辐照组（大鼠颌下腺区域给予X线辐射20 Gy及给予SMG-C6细胞15 Gy X线辐射）和甘草甜素预处理组（辐射前1小时在大鼠腹腔注射GL 4 mg/kg及使用甘草甜素10μM孵育SMG-C6细胞）。在X线（15 Gy）辐射SMG-C6细胞48小时后,（1）倒置相差显微镜记录各组细胞形态变化;（2）CCK-8细胞活性检测试剂盒检测甘草甜素对辐射后细胞活性的影响;（3）用氧化应激标志物丙二醛（malondialdehyde,MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）、过氧化氢酶（catalase,CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase,GSH）检测试剂盒检测甘草甜素对辐射后细胞中抗氧化防御系统的影响;（4）Mito SOX检测试剂盒检测甘草甜素预处理对辐射后细胞中线粒体活性氧（reactive oxygen species,ROS）的影响;（5）用JC-10检测试剂盒检测甘草甜素对辐射后线粒体膜电位的影响;（6）用ATP检测试剂盒检测各组细胞的ATP水平。在X线（20 Gy）辐射大鼠颌下腺区域后第7天取颌下腺组织,（7）苏木精-伊红（hematoxylin-eosin,HE）染色观察甘草甜素对辐射后大鼠颌下腺的影响;（8）透射电子显微镜观察甘草甜素对辐射后颌下腺组织中线粒体的影响;（9）免疫荧光双标实验检测甘草甜素对辐射后线粒体合成蛋白PGC-1α和NRF1/2的表达和共定位的影响;（10）提取颌下腺细胞和组织中的总蛋白,检测线粒体合成蛋白TFAM以及凋亡蛋白cytochrome c和cleaved-caspase 3的表达;（11）TUNEL法检测甘草甜素对辐射后颌下腺组织中的凋亡细胞的影响;（12）匹罗卡品注射大鼠后检测甘草甜素对辐射后大鼠唾液腺流率的影响。结果:（1）倒置显微镜观察细胞形态,与单纯辐照组相比,甘草甜素预处理组细胞生长状态较好,细胞膜及胞核形态较完整;（2）CCK-8结果提示,与单纯辐照组相比,甘草甜素预处理组细胞活性的保护效果最显著;（3）抗氧化防御系统检测结果显示,与单纯辐照组相比,甘草甜素预处理组中MDA活性减少,而SOD活性,CAT和GSH含量均增加;（4）Mito SOX检测结果显示,与单纯辐照组相比,甘草甜素处理组细胞ROS荧光强度显著降低;（5）JC-10检测结果显示,甘草甜素维持辐射后细胞线粒体膜电位与对照组一致;（6）ATP检测结果显示,甘草甜素预处理使辐射后细胞的ATP产量增加;（7）HE染色显示甘草甜素预处理可以减轻辐照组颌下腺腺泡细胞萎缩及空泡变性;（8）透射电镜观察,甘草甜素预处理减轻辐射导致的线粒体形态结构的破坏;（9）免疫荧光双标结果显示,与单纯辐照组相比,甘草甜素预处理使PGC-1α/NRF1和PGC-1α/NRF2的表达和共定位均增加;（10）Western blot结果显示,与单纯辐照组相比,甘草甜素预处理使TFAM表达增加而胞浆cytochrome c和组织cleaved-caspase 3水平均下调;（11）TUNEL染色结果显示,与单纯辐照组相比,甘草甜素预处理组TUNEL阳性细胞数明显减少;（12）颌下腺功能检测结果显示,甘草甜素抑制辐射引起的唾液腺流率和唾液腺流量下降,而维持唾液腺功能与对照组相似。结论:甘草甜素能够预防辐射后颌下腺组织结构的损伤,其机制为甘草甜素能在线粒体水平预防电离辐射所致的颌下腺损伤,促进腺体结构稳定和功能修复。甘草甜素可成为防治唾液腺辐射损伤的安全有效的药物。
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