胭脂红(Ponceau 4R, P4R)又称丽春红4R,酸性红18,是目前我国使用最广泛、用量最大的一种单偶氮类人工合成色素,由于其成本低廉、色泽鲜艳、着色力强、配色方便,在我国食品生产加工等行业中被广泛应用。然而,后来的一些研究表明胭脂红具有潜在的毒性。自2008年起,欧洲、北美等多个国家己陆续禁止在食品中添加胭脂红,我国虽然也对其使用范围和使用限量都有严格的规定,但仍然存在严重的滥用现象。一些食品加工者利用胭脂红的特性超量或超范围的添加到包括饮料、零食、海鲜、肉制品等食品当中,对我们的食品安全构成威胁,胭脂红残留的现有检测方法主要是传统的仪器分析法,如色谱法、质谱法、光谱法及电化学分析法等,常用的主要是高效液相色谱法。然而,仪器分析法不仅需要贵重的仪器及相关标准品,其较为繁琐的样品处理过程还需要相关技术人员进行操作,这些不方便因素使得以上检测方法并不适用于现场高通量的样品检测。因此,设计一种简单、有效、快速的现场检测方法十分必要,免疫分析法由于基于抗原抗体的特异性结合而具有高度的选择性和灵敏度,其检测方法简单、高效且便于携带,适合现场大批量样品的快速筛选,目前仅见到针对胭脂红的多克隆抗体,这大大降低了免疫分析方法的特异性,其效果较单克隆抗体差的很多。本实验采用卤代羧酸法与戊二醛法分别合成了胭脂红及其衍生物的免疫原和检测原,经过透析、鉴定后对比得到稳定、效价高、免疫效果良好的免疫原和准确、间隔臂干扰低的检测原。用合成的免疫原分批对BALB/c小鼠进行免疫,通过细胞融合技术、ELISA及icELISA技术筛选出所需要的杂交瘤细胞,利用小鼠腹水诱生法制备出能够检测胭脂红的高特异性、亲和力的单克隆抗体,并在此基础上建立合适的ELISA试剂盒工作方法。1.P4R完全抗原的合成及鉴定胭脂红属于小分子半抗原,其分子结构中并没有可直接与蛋白进行偶联的羧基或氨基,因此实验设计使用卤代羧酸法将分子上的羟基与次氯酸钠反应,连接上带有羧基的间隔臂,再经活性脂法与载体蛋白(BSA,OVA)进行偶联得到完全抗原A；同时设计用硝酸给胭脂红分子萘环5位引入一个硝基,然后用钯碳和氢气还原成氨基制得胭脂红的衍生物,经戊二醛两步法与载体蛋白偶联,得到完全抗原B。两种完全抗原经紫外光谱扫描和SDS-PAGE凝胶电泳鉴定均初步判定偶联成功。利用BCA试剂盒测得P4R-BSA和P4R-OVA的蛋白浓度分别为4.65mg/mL和3.17mg/mL,P4R-NH2-BSA和P4R-NH2-OVA的蛋白浓度分别为2.87mg/mL和2.21mg/mL。其中经对比完全抗原A较完全抗原B的偶联效果更好,因此最终选择完全抗原A进行下一步试验。2.P4R单抗的制备使用P4R-BSA作为免疫抗原按照常规动物免疫方案对BALB/c小鼠进行免疫,以P4R-OVA为检测抗原对五免7d后的小鼠血清检测抗体效价达到1：16000以上。利用细胞融合技术、ELISA方法和有限稀释法进行细胞亚克隆并筛选出三株可持续分泌抗P4R抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为6A3、6B6和7C6。利用小鼠体内诱生法制备了抗P4R单克隆抗体的腹水,其蛋白浓度为29.8mg/mL、25.1mg/mL和24.7mg/mL；抗体效价分别为32000、32000和64000,对比发现腹水7C6的效果最好。采用HiTrap Protein G HP纯化柱纯化腹水7C6,纯化后经SDS-PAGE鉴定杂蛋白明显减少。交叉实验结果表明该单抗与罗丹明B、副品红、中性红、橙黄II、柠檬黄、日落黄、苋菜红没有交叉反应,而对胭脂红的抑制率为100%。3.ELISA检测方法的建立利用纯化后的单克隆抗体建立检测P4R的间接竞争ELISA方法,抗原的最佳工作浓度为1：800,抗体的最佳工作浓度为1：16000,P4R浓度在5-5000ng/mL时,标准曲线线性良好,线性方程为y=0.2207x+0.0003(R2=0.9931),IC50为172.97ng/mL,LOD低于2ng/mL,LOQ低于5ng/mL4.鲜肉中P4R添加回收试验对鲜肉进行添加回收试验,样品需经过前处理后才能用于试验鉴定。实验结果显示鲜肉样品处理液稀释16倍以上时,样品的基质干扰基本消失。在5-5000ng/mL范围内,曲线标准方程为y=0.2731x-0.1457,相关系数R2=0.9564,ICso为256.94ng/mL,LOD低于5ng/mL,LOQ低于15ng/mL。用50、200、1000ng/mL的P4R标准液做添加回收试验,经检测鲜肉样品回收率在85.2～94.4%之间。