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正常情况下,胃粘膜具有强大的屏障功能和可再生的修复能力以应对胃粘膜受到的损伤。引起胃粘膜损伤的常见因素有胃酸过多、幽门螺杆菌感染、饮酒、吸烟以及不当饮食等。反复、持久的胃粘膜损伤会引起胃粘膜毛细血管的广泛损害以及血管通透性的增加,严重时会导致胃溃疡、胃出血、胃穿孔,甚至发展为癌前病变和胃癌,持续的胃粘膜损伤已被证实与胃癌前病变以及胃癌的发生有关。目前对于胃粘膜损伤的治疗方法仍然十分有限,包括使用H2受体阻断剂、质子泵抑制剂以及胃粘膜保护剂等,以上治疗方式对胃粘膜损伤具有一定的疗效,但也存在各自的局限性且停药后易复发。目前已有很多不同的胃粘膜损伤模型被应用于研究,如乙醇诱导的胃粘膜损伤模型、幽门螺杆菌感染模型等。慢性萎缩性胃炎(Chronic atrophic gastritis,CAG)是指胃粘膜上皮在反复持续的损伤刺激下出现固有腺体减少甚至消失、伴或不伴幽门腺化生和肠腺化生的一种慢性胃炎。在慢性幽门螺杆菌感染下CAG可以再进展为肠上皮化生和上皮内瘤变。CAG是胃癌前病变的一种形式,与胃癌的形成密切相关。虽然胃癌发生的具体机制还不明确,但通常认为是从CAG、肠上皮化生以及肠型腺癌多阶段进展而来。CAG每年的癌变率为0.5%～1%,由此带来了严重的公共卫生和社会问题。对于CAG的治疗,尽管已经有一些研究发现了部分具有疗效的药物如叶酸等,但临床上仍然缺乏有效的治疗手段和药物,开发更多更有效的治疗CAG的药物对于降低胃癌发病率以及减轻CAG所带来的社会负担都具有重要的意义。甘草多糖是一种从甘草中提取的活性多糖。甘草多糖含有大量的还原结构,具有很强的还原性,且其生物活性与空间结构相关。目前的研究发现甘草多糖具有免疫调节、抗肿瘤、抗病毒、抗炎和抗氧化的作用,但其在CAG病变中是否具有胃粘膜细胞保护及治疗作用还不得而知,本研究将探讨甘草多糖对CAG病变胃粘膜细胞的保护作用及其机制。第一部分:甘草多糖对乙醇诱导的胃粘膜细胞损伤的保护作用的研究目的:探讨甘草多糖对乙醇诱导的胃粘膜细胞损伤的保护作用及相关的机制方法:①体外培养胃粘膜细胞GES-1,用不同浓度的乙醇(0.2M、0.4M、0.6M、0.8M 和 1.0M)和甘草多糖(Glycyrrhiza polysaccharides,GPS)(100μg/ml 和 400μg/ml)处理GES-1细胞并诱导其损伤,分别在诱导后2h、6h和12h采用RTCA技术进行细胞指数(Cell index,CI)检测;②细胞分组和处理:细胞随机分为4组,分别为对照组、乙醇诱导模型组、GPS1+乙醇诱导组以及GPS2+乙醇诱导组,其中乙醇浓度为0.8M,GPS1的浓度为100μg/ml,GPS2的浓度为400μg/ml,乙醇的作用时间为12h,GPS为在乙醇诱导前先处理细胞6h;③CCK-8法检测细胞活力;④流式细胞术检测细胞凋亡情况;⑤western blot和RT-PCR检测Bcl-2、Bax和AKT-Mdm2-p53通路蛋白水平以及mRNA水平的表达;⑥用PI3K抑制剂LY294002处理各组细胞后再检测细胞的活力、凋亡情况以及Bcl-2、Bax和AKT-Mdm2-p53通路蛋白水平以及mRNA水平的表达。结果:①RTCA检测显示:当乙醇浓度≥0.6M时,乙醇诱导组细胞的CI明显下降,即细胞增殖能力下降(P<0.05或P<0.01);GPS(100μg/ml和400μg/ml)处理组细胞的CI无明显改变,即GPS对正常细胞增殖能力无影响。依据细胞活性结果,0.8M的乙醇被用于细胞损伤的浓度;②CCK-8检测显示:与正常对照组细胞相比,0.8M乙醇处理组细胞活力明显下降(P<0.01),与乙醇诱导组相比,GPS1+乙醇诱导组和GPS2+乙醇诱导组细胞活力升高(P<0.05);③凋亡检测显示:与对照组细胞相比,乙醇处理诱导了 GES-1细胞的凋亡(20.56±1.95%vs 2.54±0.24%,P<0.01),与乙醇诱导组相比,GPS1+乙醇诱导组(12.12±0.24%,P<0.05)和GPS2+乙醇诱导组细胞(7.73±0.74%,P<0.01)凋亡细胞比例下降,即GPS抑制了乙醇诱导的GES-1细胞凋亡;④RT-qPCR和western blot显示:与对照组相比,乙醇促进了 AKT的磷酸化和p53的表达以及抑制了 Mdm2的表达,并降低了 Bcl-2/Bax的比值,GPS处理后逆转了乙醇的诱导作用,且高浓度的GPS的作用优于低浓度的GPS;⑤经PI3K抑制剂LY294002处理后,与乙醇诱导组相比,LY294002+GPS+乙醇诱导组细胞的细胞活力升高,但与无抑制剂组相比,GPS升高细胞活力的作用减弱;同时,LY294002+GPS+乙醇诱导组细胞凋亡数目降低,但与无抑制剂组相比,GPS抑制细胞凋亡的作用减弱;另外,Y294002+GPS+乙醇诱导组Bcl-2/Bax比值升高,但与无抑制剂组相比,GPS促Bcl-2/Bax比值升高的作用也减弱,即LY294002抑制了 GPS升高GES-1细胞活力的能力和GPS抑制GES-1细胞凋亡的能力,同时还抑制了 GPS升高Bcl-2/Bax比值的作用。结论:①乙醇能通过降低胃粘膜细胞活力和诱导胃粘膜细胞凋亡来促使细胞损伤;②GPS可以抑制乙醇诱导的胃粘膜细胞损伤;③GPS是通过调控AKT-Mdm2-p53通路以及提高Bcl-2/Bax的比值来保护胃粘膜细胞的。第二部分:甘草多糖对慢性萎缩性胃炎大鼠胃粘膜的保护作用的研究目的:探讨甘草多糖对慢性萎缩性胃炎大鼠胃粘膜的保护作用及其机制方法:①采用20mM去氧胆酸钠、60%酒精和0.1%氨水综合处理来建立大鼠CAG模型;②将30只重量在200g～220g的SD大鼠分为对照组、CAG模型组和GPS干预组,每组10只大鼠,雌雄各半。其中对照组常规饲养12周,GPS干预组为在CAG模型建立的同时给大鼠灌胃GPS(100mg/100g),每天一次,持续12周;③12周后取材,开腹取胃,将胃展开置于蓝色背景桌纸上,肉眼观察胃粘膜情况并拍照;④将胃粘膜组织固定于10%中性甲醛液中并进行病理HE染色;⑤免疫组化染色(p-AKT、p53 和 Mdm2);⑥RT-qPCR 和 western blot 检测胃粘膜组织中 p-AKT、p53、Mdm2、Bcl-2和Bax mRNA水平以及Bcl-2和Bax蛋白水平的表达;⑦采用试剂盒检测胃粘膜组织中SOD、MDA和GSH的含量。结果:①肉眼观察可见对照组大鼠胃粘膜无异常,无溃疡,无出血,而CAG模型组大鼠胃粘膜有出血、溃疡,GPS干预组大鼠胃粘膜有少量出血点,但严重性明显低于CAG模型组;②HE染色显示:与对照组相比,CAG模型组大鼠胃粘膜组织可见腺上皮细胞排列不规则,腺体厚度减少,同时粘膜肌层厚度增加,有炎性细胞浸润,腺体萎缩;GPS组可见腺体细胞排列较规则,腺体萎缩不明显,炎性细胞浸润明显低于CAG组。③免疫组化显示:与对照组相比,CAG模型组大鼠胃粘膜组织中p-AKT、p53表达升高,而Mdm2表达降低;与CAG模型组相比,GPS干预组大鼠胃粘膜组织中p-AKT、p53表达降低,而Mdm2表达升高。④Western blot显示:与对照组相比,CAG模型组胃粘膜组织中Bcl-2表达下降,Bax表达升高,即Bcl-2/Bax比值下降;与CAG模型组相比,GPS干预组中Bcl-2/Bax比值升高。⑤RT-qPCR显示:与对照组相比,CAG模型组中Mdm2和Bcl-2 mRNA表达降低,而p53和Bax mRNA表达升高(P<0.01);与CAG模型组相比,GPS干预组中Mdm2和Bcl-2 mRNA表达升高,p53和BaxmRNA表达降低(P<0.05)。⑥与对照组相比,CAG模型组胃粘膜组织中 SOD(2.56±0.43μmol/l vs 0.89±0.12μmol/l,P<0.05)和 GSH(11.94±1.32μmol/l vs 5.99±0.68μmol/l,P<0.05)含量降低,而 MDA(1.84±0.26μmol/l vs 3.89±0.44μmol/l,P<0.05)含量升高;与CAG模型组相比,GPS干预组中SOD(1.60±0.18μmol/l)和GSH(8.91±0.78μmol/l)含量升高(P<0.05),而 MDA(1.99±015μmol/l)含量降低(P<0.05)。结论:①CAG大鼠胃粘膜组织中会出现粘膜腺体厚度减少、粘膜肌层厚度增加、炎性细胞浸润和腺体萎缩的病理改变,而GPS可以抑制这些病理改变,即抑制了 CAG的形成和进展。②CAG大鼠胃粘膜组织中AKT-Mdm2-p53通路发生了改变,而GPS可以调控该途径的改变。③CAG大鼠胃粘膜组织中Bcl-2/Bax比值下降,而GPS可以促进Bcl-2/Bax比值的升高,即抑制了细胞凋亡。④GPS可能通过提高胃粘膜组织中SOD和GSH含量和降低MDA的含量来在CAG大鼠中发挥抗氧化的作用。