基因干扰(RNA interference,RNAi)是现代分子生物学领域的重大发现,该机制在不同进化地位的物种中高度保守。在昆虫学领域中,RNAi技术不仅为昆虫的功能基因组研究提供了便捷的方法,也为农业害虫的防治提供了新途径。然而,脱靶效应(off target effect)给RNAi技术蒙上了阴影,是目前RNAi技术应用的最大障碍。严重的脱靶效应会导致应用RNAi进行昆虫功能基因组学研究产生错误结论,如果利用RNAi进行害虫防治出现脱靶效应,就会因为靶标的非特异性而出现严重的环境安全性问题,甚至影响人类健康。因此,在应用RNAi进行害虫防控的研究中,昆虫体内脱靶效应的评估和控制是一个亟待解决的科学问题。本文以赤拟谷盗Tribolium castaneum为研究对象,通过选择合适的RNAi物质,利用微阵列芯片研究RNAi过程中脱靶效应的发生并探讨可能存在的原因,同时评估了dsRNA脱靶效应预测软件"dsCheck"的准确性,然后研究了与序列相关脱靶效应相关的dsRNA分子特征,验证了RNAi过程中非序列特异性脱靶效应的存在。相关的研究成果可以为未来dsRNA的设计以及安全控制提供理论依据,促进RNAi技术的实践应用。1.赤拟谷盗中SiRNA与dsRNA引发的RNAi效应比较siRNA与dsRNA都被广泛地应用于沉默靶标基因,但实践发现在昆虫活体中siRNA很难引发RNAi的表型变化。为了证实这一现象同时选择合适的昆虫RNAi方法,本研究选择赤拟谷盗为研究对象,来比较siRNA与dsRNA的干扰效率。实验利用4个dsRNA和10个siRNA靶向3个不同基因,分别测试了这些干扰RNA对靶标基因的抑制效率以及导致试虫的畸形率。结果发现注射不同dsRNA均可以有效抑制目标基因的表达量(55-75%),且能持续抑制超过7天,并导致78.8-87.0%的试虫畸形。但是注射不同的siRNA,多数对靶基因的表达没有显著的抑制作用,10个siRNA只有1个沉默了45%的靶标基因表达量,抑制持续了仅3天,所有siRNA处理均未能引发试虫产生表型变化(畸形)。上述结果表明,siRNA明显比相应的dsRNA干扰效率低,而且大部分不能引起表型变化。此外,siRNA的干扰效率随其分子不同,或靶向位置而有很大变化,因此应用siRNA需要仔细筛选。2.赤拟谷盗中dsRNA引起的脱靶效应利用转基因作物或工程生物表达dsRNA进行害虫防治具有较好的前景,但目前对昆虫dsRNA脱靶效应的研究较少,很难进行生物安全控制。本实验利用赤拟谷盗RefSeq数据库定制的微阵列芯片,通过检测沉默TcChi1之后赤拟谷盗体内各种基因的表达情况,对dsRNA的脱靶效应进行了研究。结果发现两个靶向TcChil基因的不同dsRNA处理赤拟谷盗后,分别导致了217和225个基因产生显著的表达量变化(2倍以上,且差异显著),其中分别有141和151个基因显著下调。这些基因的功能多样,大都与代谢过程、外界刺激以及生物学调节相关。通过生物信息学的方法,依据序列匹配度鉴定脱靶基因发现在赤拟谷盗中利用dsRNA进行RNAi,不存在已报道的siRNA种子区脱靶效应,只是当基因序列中具有一段长度在19nt以上,且与dsRNA匹配约90%的序列片段时,其脱靶概率显著高于其他基因。此外,还发现一个基因与RNAi的免疫副反应有关,推测RNAi可能产生非序列特异性免疫反应。由此认为,利用dsRNA进行赤拟谷盗RNAi,可以通过不同途径引起不同基因产生脱靶效应,其中与dsRNA具有高度相似性的同源基因,脱靶概率明显高于其他基因。该实验研究结果对dsRNA的设计以及加深对dsRNA引发脱靶效应的认识具有重要意义。3.预测软件dsCheck对dsRNA脱靶效应的预测为了提高RNAi的专一性以及预测脱靶效应的发生,生物信息学家根据已知RNAi脱靶效应的原理,设计出了不同算法用于预测脱靶效应,其中dsCheck是专门预测dsRNA脱靶效应的软件。本研究利用该软件对第三章中所使用的两个dsRNA的脱靶基因进行预测,并与实际微阵列芯片检测结果对比,以期验证该软件的预测效果,探索可能的改进途径。结果发现,在赤拟谷盗中dsCheck软件预测dsChi1和dsChi2分别会导致691个和519个基因脱靶,与微阵列芯片检测结果比对发现,其中分别只有10个和14个基因的表达受抑制。分析发现dsCheck软件的预测准确率,随理论生成的siRNA与预测脱靶基因的序列相似性降低而急剧下降,序列相似性在94%、89%和84%时,对2个dsRNA脱靶效应的预测准确率分别为14.3%和33.3%、2.6%和8.3%,以及1.0%和1.7%。在果蝇活体和S2细胞中利用dsWg进行RNAi实验,dsCheck预测都有23个基因脱靶,但实际检测发现,分别仅有12个和3个基因表达受到抑制,表明昆虫活体内的脱靶效应和组培细胞中的有所不同。这些研究结果均表明dsCheck软件预测dsRNA的脱靶基因准确率极低,主要是由于目前预测软件仅依据理论生成siRNA与基因组内不同基因的相似性,没有掌握dsRNA脱靶的发生规律,故还需深入开展研究。4.影响dsRNA脱靶效应的分子特征RNAi的效应分子与非靶标基因的互作,造成非靶标基因的沉默称为RNAi的脱靶效应。本文基于目标基因沉默水平,利用定量PCR方法评估了dsRNA分子的两个重要特征对脱靶效应的影响。结果首先发现,在赤拟谷盗中,当dsRNA序列与mRNA序列相似度超过50%时,脱靶效应发生的概率逐渐增加,当相似度达到80%时,这些非靶标的mRNA将与靶标基因一样被沉默。然后使用嵌合dsRNA序列检测发现,当dsRNA序列与mRNA序列有一段40bp或者两段30bp的连续匹配时,就能够引发RNAi效应,而较短的匹配片段则无法触发RNAi反应。这些结果提供了昆虫体内评估dsRNA脱靶效应的两个标准,这不仅会改善dsRNA的设计,同时会为未来RNAi的使用提供更好的理论依据。5.赤拟谷盗RNAi过程中非序列特异性脱靶效应的探索昆虫体内的免疫反应是昆虫机体抵抗外界物质侵染的能力,RNAi作为昆虫消除外界病毒RNA的重要途径在进化上相对保守,而对外源双链RNA是否能够引发昆虫的免疫应答还存在争论。根据先前研究结果,本实验首先选择15个与昆虫免疫应答相关的基因检测注射外源dsRNA之后24h的基因表达情况,发现两个基因Defensin1和Defensin2明显高表达;随后的研究发现不同长度和不同浓度的dsRNA能够提高这两个基因的表达量,进一步证实了外源双链RNA引发昆虫免疫基因应答的反应。这一结果表明,在赤拟谷盗中,利用dsRNA进行RNAi,可以通过免疫反应引发序列无关基因产生脱靶效应。