[研究目的]致心律失常性右室心肌病(Arrtythmogenic right ventricular cardiomyopathy,ARVC)是一种右心室心肌被进行性纤维脂肪组织所替代的心肌病,临床表现为右心室扩大、室性心律失常和心源性猝死,最终导致心力衰竭,严重危害人民健康。ARVC具有遗传性,目前已知至少9个ARVC相关基因,包括桥粒蛋白基因以及非桥粒蛋白基因。其中,跨膜蛋白43基因(Transmembrane protein43,TMEM43)是ARVC相关的非桥粒蛋白基因,然而对于该基因的功能知之甚少,对于该基因突变如何引起ARVC疾病发生很不清楚。因此,基于已有文献和前期工作基础,本课题的研究目的是:建立携带TMEM43基因突变的ARVC疾病诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSC)衍生的心肌细胞模型,揭示ARVC的疾病表型,阐明TMEM43基因突变引起ARVC疾病发生的分子机制。[研究方法]我们入组了 1例携带有TMEM43基因突变的ARVC病人及3例健康受试者,成功建立了 ARVC“病人特异性”的iPS细胞株,获得了 ARVC“病人特异性”iPSC衍生的心肌细胞(iPSC-CMs);应用CRISPR/Cas9基因组编辑技术在ARVC病人iPSC水平上进行TMEM43基因突变的定点矫正,获得与病人细胞基因型完全相同的等基因型iPS细胞株(isogeniciPSC lines),作为后续研究中更为严格的对照;详细比较正常人组(对照组)、ARVC病人组(病人组)和基因校正组(校正组)心肌细胞的功能学差异,包括细胞形态学、脂肪沉积、电生理、钙成像、细胞凋亡等检测,揭示病人组心肌细胞的功能学表型,建立ARVC疾病细胞模型;对病人组心肌细胞的电生理以及病人组心肌细胞的脂肪沉积进行检测;在正常组心肌细胞中分别过表达野生型和突变型TMEM43进一步验证其功能学表型;通过转录组测序分析(RNA-Seq analysis)发现与ARVC疾病发生相关的关键基因和信号通路,并通过质谱分析进一步寻找与TMEM43相互作用的靶蛋白,阐明TMEM43基因突变引起ARVC疾病发生的分子机制。[研究结果]应用体细胞重编程技术建立了对照组和病人组的iPS细胞株。应用CRISPR/Cas9基因组编辑技术对病人组iPS细胞进行TMEM43基因突变的定点矫正,获得校正组iPS细胞株。应用基于小分子化合物的方法学将对照组、病人组和校正组iPS细胞定向分化为心肌细胞。应用心肌特异性标志物TNNT2和α-actinin进行心肌细胞的免疫染色,结果显示不同组细胞的大小、多核细胞比例以及肌丝纹理排列无显著性差异。应用尼罗红染色和透射电镜分析心肌细胞的脂肪沉积,结果显示与对照组和校正组相比,病人组细胞中出现显著增多的脂肪沉积表型。应用TUNEL染色检测心肌细胞的凋亡,结果显示不同组细胞的凋亡无显著差异。应用膜片钳技术记录心肌细胞的动作电位,结果显示与对照组和校正组相比,病人组细胞表现出显著的心律不齐和心律失常表型。应用膜片钳技术记录心肌细胞的钠通道电流,结果显示与校正组相比,病人组细胞的钠电流显著减小,稳态激活与失活曲线发生显著右移,表现为钠通道功能缺失表型。在正常组心肌细胞中分别过表达野生型和突变型TMEM43,结果显示过表达突变型TMEM43的心肌细胞表现出显著的心律不齐和心律失常,验证了病人组心肌细胞中的电生理表型,也证明了 TMEM43突变为致病性突变。应用校正组和病人组心肌细胞样本进行转录组测序以及生物信息学分析,结果显示差异表达基因富集在NF-κB、钙调控、TGF-β、ARVC、PPAR等信号通路。对NF-κB信号通路进行验证,Western Blot结果显示与校正组心肌细胞相比,病人组细胞中的IκBα和P65的蛋白磷酸化水平显著上调,提示NF-κB信号通路参与了 ARVC疾病的发生。对钙调控通路进行验证,Western Blot结果显示与校正组心肌细胞相比,病人组细胞中RYR2和SERCA2a的蛋白表达显著下降,PLN的蛋白磷酸化水平显著升高、而NCX1和Cav1.2的蛋白表达无显著变化;应用Fluo-4和Fura-2弓成像技术记录心肌细胞的钙信号,结果显示与校正组相比,病人组细胞中出现钙信号紊乱表型,与观察到的电生理表型一致,提示钙信号调控紊乱可能引起了病人组心肌细胞的电生理表型并参与了 ARVC疾病的发生。[结论]我们成功建立了 ARVC“病人特异性”的iPS细胞株,并通过定点矫正TMEM43突变建立了等基因型的iPS细胞株,ARVC“病人特异性”iPSC-CMs表现出脂肪沉积、心律不齐、心律失常、钠通道功能缺失等疾病表型,RNA-Seq分析及后续的功能学验证提示NF-κB和钙调控信号通路异常是ARVC疾病发生的可能机制。