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目的探索乌灵胶囊联合卡马西平(carbamazepine,CBZ)对海人酸(kanic acid,KA)致癫大鼠的抑制作用,Morris水迷宫考察对大鼠学习记忆功能的影响,苏木精-伊红染色(HE)考察对大鼠海马神经元的保护作用,研究乌灵胶囊对CBZ在难治性癫痫大鼠体内药代动力学的影响;免疫组化、Western Blot、RT-PCR法检测对癫痫大鼠脑组织及海马组织内HMGB1、TLR4、NF-κB/p65及P-gp/MDR1表达的影响,为进一步探讨乌灵胶囊联合CBZ逆转难治性癫痫耐药的作用机制提供理论依据。方法1.将清洁级健康成年雄性Wistar大鼠分为空白组、模型组、CBZ组、CBZ+低剂量(0.3g/kg)乌灵胶囊组(CBZ+L)、CBZ+中剂量(0.6g/kg)乌灵胶囊组(CBZ+M)、CBZ+高剂量(1.2g/kg)乌灵胶囊组(CBZ+H),每组8只,共6组。海马CA3区注射生理盐水建立空白实验组,其余注射KA诱导难治性癫痫大鼠模型组。术后空白组和模型组的大鼠每天灌服生理盐水,剩余组大鼠分别以80mg/kg CBZ、80mg/kg CBZ+0.3g/kg乌灵胶囊、80mg/kg CBZ+0.6g/kg乌灵胶囊、80mg/kg CBZ+1.2g/kg乌灵胶囊灌胃给药,1次/天,6天/周期,共10周期。监测各组大鼠症状的变化,记录发作级别和发作频次。2.取上述造模成功的大鼠,每组8只,共6组,于灌胃给药60d后行Morris水迷宫实验,记录大鼠逃避潜伏期的时间及穿越原设定平台位置的次数。3.Morris水迷宫实验结束后,随机选取Wistar大鼠18只,每组3只,共6组,以10%的水合氯醛(0.35ml/kg)腹腔注射麻醉,生理盐水及4%的多聚甲醛沿心尖注射灌注,断头取脑,石蜡包埋切片,HE染色进行病理学检查。4.取造模成功后的大鼠124只,随机分为血药浓度组和脑药浓度组。血药浓度组分为CBZ组、CBZ+L组、CBZ+M组、CBZ+H组,每组6只,共4组;脑药浓度分组方法同上,每组25只,共4组。CBZ组灌胃给予生理盐水,CBZ+L组、CBZ+M组、CBZ+H组分别给予0.3g/kg、0.6g/kg、1.2g/kg乌灵胶囊,1次/天,连续7天,第8天灌胃给药30min后,分别灌胃给予CBZ(80mg/kg),于事先设计好的时间点通过内呲静脉采集血液、脑组织,HPLC法测定血浆及脑组织中CBZ的浓度。5.随机选取灌胃给药60d的大鼠,每组3只,共6组。以10%的水合氯醛(0.35ml/kg)腹腔注射麻醉,生理盐水及4%的多聚甲醛灌注,断头取脑,石蜡包埋切片,免疫组化法观察各组大鼠脑组织内HMGB1、TLR4、NF-κB/p65及P-gp蛋白,应用Image Pro Plus6.0软件统计分析各组相应蛋白的表达情况。6.取灌胃给药60d的大鼠,每组3只,共6组。按上述方法取脑,剥离出完整海马组织后,通过实时定量PCR法检测各组HMGB1、TLR4、NF-κB/p65及MDR1 mRNA的表达情况。7.按上述方法剥离出完整海马组织后,通过Western Blot法测定各组大鼠海马中HMGB1、TLR4、NF-κB/p65及P-gp蛋白,应用Quantity one 4.6.2软件统计分析各组相应蛋白的表达情况。结果1.长期单用CBZ可降低KA诱导的难治性癫痫大鼠发作级别,对发作频次无明显抑制作用;联合给予低、中、高剂量乌灵胶囊既可抑制癫痫发作级别,同时也可降低癫痫发作频次,其中联合给予中、高剂量乌灵胶囊效果优于单用CBZ(P<0.05)。2.随着实验天数的延长,单用CBZ和CBZ联合低、中、高剂量乌灵胶囊组大鼠定位航行所用时间与模型组相比均显著降低(P<0.01),且联合用药组效果优于单用CBZ组(P<0.01);CBZ联合中、高剂量乌灵胶囊组的大鼠穿越有效平台的频次显著高于模型组和CBZ组(P<0.05)。3.HE染色结果示:与单用CBZ相比,CBZ+M组、CBZ+H组大鼠海马神经元出现细胞核固缩、溶解和裂解的情况有所改善,同时神经元细胞数量也相对较多。4.与CBZ组相比,CBZ+M组、CBZ+H组癫痫大鼠血浆中CBZ的药时曲线下面积AUC(0~8h)和最大血药浓度Cmax显著增加(P<0.05),血浆清除率CLz/F显著降低(P<0.01);CBZ+M组、CBZ+H组癫痫大鼠脑组织中CBZ的浓度也显著增高(P<0.05)。5.IHC实验结果示:KA诱导的癫痫大鼠脑组织和海马组织内HMGB1、TLR4、NF-κB/p65及P-gp蛋白表达显著升高(P<0.05)。与模型组相比,CBZ+M组、CBZ+H组大鼠脑和海马组织内HMGB1、TLR4、NF-κB/p65、P-gp蛋白显著降低(P<0.05),CBZ组大鼠海马组织内HMGB1、TLR4、NF-κB/p65蛋白降低无显著性差异,但P-gp蛋白表达有升高趋势;CBZ+L组大鼠脑内HMGB1、TLR4蛋白显著降低(P<0.01),NF-κB/p65蛋白有降低趋势(P<0.05),P-gp蛋白表达升高无显著性差异。与CBZ组相比,CBZ+M组、CBZ+H组大鼠脑和海马组织内HMGB1、TLR4、P-gp蛋白显著降低(P<0.01),NF-κB/p65蛋白表达有降低趋势(P<0.05),CBZ+L组4种蛋白降低不明显。6.RT-PCR实验结果示:KA诱导的癫痫大鼠海马组织内HMGB1、TLR4、NF-κB/p65及MDR1 mRNA显著升高。与CBZ组相比,CBZ+M组、CBZ+H组癫痫大鼠海马组织内HMGB1、TLR4、NF-κB/p65及MDR1 mRNA显著降低(P<0.05)。7.WB实验结果示:与空白组相比,模型组、CBZ组、CBZ+L组、CBZ+M组、CBZ+H组大鼠海马组织内HMGB1、TLR4、P-gp蛋白显著升高(P<0.05),模型组、CBZ组、CBZ+L组、CBZ+H组NF-κB/p65蛋白显著升高(P<0.05)。与模型组相比,CBZ+M组、CBZ+H组大鼠海马组织内HMGB1、TLR4、NF-κB/p65、P-gp蛋白显著降低(P<0.01)。与CBZ组相比,CBZ+M组、CBZ+H组大鼠海马组织内HMGB1、TLR4、NF-κB/p65、P-gp蛋白显著降低(P<0.01)。结论乌灵胶囊联合CBZ对KA致癫大鼠的痫性发作有抑制作用,可改善癫痫导致的大鼠学习记忆能力的减退,缓解海马神经元的损伤,提高CBZ在癫痫大鼠血液及脑组织内的分布,具有逆转难治性癫痫耐药的作用,其机制可能是缓解了KA诱导的癫痫反复发作导致的脑损伤,抑制了海马组织HMGB1蛋白高表达、降低TLR4的活化、抑制NF-κB/p65,从而下调耐药基因P-gp产生而发挥作用。