乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，因此乳腺癌的防治研究历来受到极大关注。近年来，乳腺癌的生物免疫治疗研究有了新的进展，成为继手术、放疗、化疗和内分泌治疗以外的一种新的治疗手段。　　 肿瘤生物治疗中免疫细胞、肿瘤疫苗、免疫基因治疗等在肿瘤治疗中已取得了很大的进展，尤其以树突状细胞(dendritic cell，DC)为基础的疫苗制作和诱导产生抗原特异性CTL对肿瘤进行主动免疫成为研究热点。DC是目前所知的机体内功能最强的专职性抗原提呈细胞(antigen presenting cell，APC)，其特点是具有很强的诱导初次免疫应答的能力，能有效激发T细胞应答，诱导特异性的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes，CTL)生成，因此DC是机体免疫反应的始动者。激活的CTL又分多种亚群，其中CD8+CTL为主要的杀伤细胞，激活的CD8+T具有记忆功能，当遇到表达相同抗原的靶细胞时，就会启动杀伤机制，将细胞杀死。然而与人体其他恶性肿瘤一样，乳腺癌来自自身细胞的突变，故其抗原性较弱，而且肿瘤细胞还会分泌许多因子来抑制机体DC对抗原的摄取，因此机体对肿瘤细胞的免疫反应弱，这也是导致肿瘤得以逃避机体的免疫系统不断生长的原因之一。因此要提高机体对乳腺癌的免疫杀伤必须增强DC对乳腺癌抗原的提呈;另外还要寻找乳腺癌特异性抗原，以防造成对其他正常组织的杀伤。　　 人乳腺珠蛋白(mammaglobin-A，MGBA or MGB1;也称humanmammaglobin-A，hMAM-A)是一个新的乳腺癌相关抗原，最初是在20世纪90年代初由WatsonMA和Fleming TP用mRNA差异PCR筛选方法和末端cDNA快速扩增技术发现。它的高级结构和功能都不是很清楚。然而，MGBA的独特性在于，它几乎专一性的表达在乳腺组织上，在乳腺癌上呈现过表达。因此，这使其成为一个非常有吸引力的免疫治疗靶点，也极大的引起了乳腺癌生物免疫治疗研究者的兴趣。　　 为了增强DC对抗原的提呈性，可用多种方法处理DC。其中，肿瘤抗原DNA制备简单，成本低廉，可以大规模生产，导入DC后可直接在细胞内表达活性蛋白，不易降解，故抗原性强，免疫效果好。将肿瘤抗原DNA导入DC需要借助载体，其中腺病毒载体具有安全性高、转染率高、不损害DC活性及免疫功能等诸多优势而具有无与伦比的优势。　　 因此，本研究拟构建MGBA腺病毒表达载体，然后转染人的DC细胞观察是否能增强其对MGBA的提呈;转染DC与人T细胞共培养，观察是否产生具有MGBA特异性的CD8+CTL细胞及其体外对乳腺癌的杀伤效果。从而为乳腺癌的生物治疗寻找新的途径。　　 材料与方法：　　 一、实验材料　　 1、细胞株　　 乳腺癌细胞株MDA-MB-415、HBL-100购于中国科学院上海生命科学研究院细胞库，MDA-MB-231由本室保存。　　 2、组织标本　　 外周血采集自健康女性成人志愿者。　　 二、主要研究方法　　 1、MGBA重组腺病毒的构建及鉴定:用Adxsi系统构建携带MGBA基因的复制缺陷型腺病毒载体pAdxsi-MGBA并大量制备，转染293细胞进行病毒的包装、扩增，用CsCl密度梯度离心法纯化病毒，用TCID50法测定病毒滴度，用PCR法鉴定重组腺病毒是否包含MGBA基因，并用western blot法鉴定Ad-MGBA转染的细胞是否表达MGBA蛋白。　　 2、用western blot法对乳腺癌细胞系MGBA蛋白的表达情况进行检测　　 3、用SBT的方法进行志愿者HLA-A类型的检测和筛选　　 4、健康志愿者外周血单个核细胞来源的树突状细胞的体外诱导培养及重组腺病毒转染效率的测定:用淋巴细胞分离液密度梯度离心法从健康志愿者外周血中提取单个核细胞(PBMCs)，贴壁细胞用于DC的诱导培养，用Ad-GFP转染DC，通过流式、荧光显微镜观察等摸索最适MOI值及最佳感染时间。　　 5、用Ad-MGBA重组腺病毒转染DC，用倒置相差显微镜观察DC的形态;用流式检测DC的CD80、CD83、CD86、HLA-DR的表达;用ELISA法分析DC上清中IL-10、IL-12的表达，以此研究转染对DC形态、表型、免疫学功能的影响。　　 6、CTL细胞的体外诱导培养:用Ad-MGBA等转染DC，收获成熟后与非贴壁细胞进行共培养，刺激三轮，制备MGBA特异性CTL。　　 7、用免疫磁珠进行CD8+CTL细胞的分选　　 8、用流式分析各组CD8+CTL细胞对三种乳腺癌细胞的细胞毒活性　　 9、用免疫荧光法观察乳腺癌细胞被Ad-MGBA CD8+CTL细胞杀伤后的凋亡情况　　 10、用酶联免疫斑点实验检测各组CD8+CTL细胞与三种乳腺癌细胞共培养后IFNγ的表达　　 11、统计学处理:每次实验重复3次，采用SPSS13.0统计软件包对数据进行统计分析，数据结果以(x)±s表示，以P＜0.05为判断差异显著性标准。　　 结果：　　 1、经酶切电泳、测序、PCR法鉴定，证实重组腺病毒载体Ad-MGBA构建正确，滴度达到2.5×1011pfu/ml，转染DC后能在细胞内有效表达MGBA蛋白。　　 2、重组腺病毒转染DC的最适感染复数即MOI是200，最佳感染时间是48h。　　 3、乳腺癌细胞系MDA-MB-415强表达MGBA蛋白，HBL-100弱表达，而MDA-MB-231不表达该蛋白。　　 4、DC在体外诱导培养过程中出现了典型的形态变化，CD80、CD83、CD86、HLA-DR的表达率随着成熟而表达上调，提示DC体外诱导培养成功。　　 5、重组腺病毒Ad-MGBA转染DC，促进了DC形态上的成熟，促进了CD80、CD83、CD86、HLA-DR的表达，促进了IL12的分泌，而抑制了IL10的分泌;但这些成熟指标不如添加TNF-α的DC组。　　 6、CD8+CTL杀伤肿瘤细胞的最佳杀伤比例是20∶1。　　 7、Ad-MGBA-CD8+CTL、Ad-MGBA-CD8+CTL(without TNF-α)、MGBAp-CD8+CTL在效靶比为20∶1时均能引起HLA-A33+/MGBA+ MDA-MB415细胞的有效裂解，裂解率分别是70.45％，51.67％、44.03％，而DC-CD8+CTL和Ad-null-CD8+CTL仅能引起该细胞11.14％和14.40％的裂解。而Ad-MGBA-CD8+CTLs(without TNF-α)比Ad-MGBA-CD8+CTLs对MDA-MB415细胞的裂解率要低的多(p＜0.01）。　　 8、Ad-MGBA-CD8+CTL对另两种乳腺细胞系HLA-A33-/MGBA+HBL-100和HLA-A33-/MGBA-MDA-MB231的裂解率仅达到17.01％和12.65％，明显低于对HLA-A33+/MGBA+ MDA-MB415达70.45％的裂解率，说明CD8+CTL的杀伤具有MHC限制性。Ad-null CD8+CTL和DC-CD8+CTL对三种乳腺癌的杀伤均较低且无统计学差别。　　 9、用免疫荧光法观察到，被Ad-MGBA CD8+CTL杀伤后，乳腺癌MDA-MB-415细胞大部分出现了凋亡，而MDA-MB-231细胞只有很少的细胞出现凋亡。　　 10、用酶联免疫斑点实验分析，无论是与其他四种CD8+CTL相比还是与另两种乳腺癌细胞相比时，Ad-MGBA-CD8+CTL当用MDA-MB-415刺激时呈现了最高的IFNγ水平。此外，无TNF-α的Ad-MGBA-CD8+CTLs(without TNF-α)产生的IFNγ的水平低于Ad-MGBA-CD8+CTLs(p＜0.01)，同样说明TNF-α在激活T细胞中的作用。　　 结论：　　 1、成功构建了重组腺病毒Ad-MGBA。　　 2、腺病毒转染能促进DC的表型、免疫学功能的成熟，但不能完全促进DC的成熟，仍然需要添加促成熟刺激剂如TNF-α来进一步促进DC的成熟;　　 3、TNF-α在诱导DC成熟和激活T细胞方面发挥着重要的作用;　　 4、重组腺病毒Ad-MGBA转染HLA-A33+的DC，能有效诱导MGBA抗原特异性的CD8+CTL，产生对HLA-A33+/MGBA+的乳腺癌细胞的有效裂解;　　 5、CD8+CTL对乳腺癌细胞的杀伤活性是MHC限制性的。