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犬新孢子虫(Neospora caninum)宿主范围非常广泛,终末宿主是犬,牛、羊、犬、马、猪、兔等家畜及一些野生动物和小型动物可作为中间宿主,新孢子虫病是由犬新孢子虫寄生在犬、牛、羊等多种哺乳动物细胞内所引起的一种原虫病。该病对牛、羊的危害尤为严重,是造成世界性牛流产的主要原因之一,给畜牧养殖业造成巨大的经济损失。目前还没有有效的预防方法,只能对患病家畜采取淘汰等处理方法来防治新孢子虫病,本研究旨在建立一系列灵敏、快速、准确的新孢子虫检测方法,并对多种动物进行新孢子虫病流行病学调查,为新孢子虫病防治提供依据。本研究根据新孢子虫NcSRS2序列,设计合成一对PCR引物,建立新孢子虫PCR检测方法。通过对PCR反应条件及反应体系的优化,确定其最佳反应条件。然后进行敏感性及特异性检测,构建重组质粒pMD18-T-NcSRS2,将重组质粒进行10倍的梯度稀释,以稀释后的质粒为模板,进行PCR扩增,可以扩增出10~3copies/μL,具有较好的敏感性;对新孢子虫、弓形虫、牛瑟氏泰勒虫、牛环形泰勒虫、牛双芽巴贝斯虫、牛伊氏锥虫等阳性核酸进行扩增,只能扩增出新孢子虫,其他阳性核酸均未扩出,证明该方法具有很好的特异性。根据新孢子虫NcSRS2序列,设计合成一对荧光PCR引物及一条探针,以重组质粒为模板,建立荧光PCR检测方法,然后对荧光PCR反应条件及反应体系进行优化,确定最佳反应条件,然后对其敏感性,特异性及重复性进行检测,以稀释后的质粒为模板,进行荧光PCR扩增,可以扩增到10~2copies/μL,并且只能扩增出新孢子虫的阳性基因,其它阳性基因均未扩出,证明其具有很好的敏感性及特异性,对重组质粒10~8copies/μL~10~6copies/μL进行三次扩增,其扩增时间及扩增量相似,可以证明其具有很好的重复性。根据Nc5基因设计4条特异性引物,建立新孢子虫LAMP(环介导等温扩增)快速检测方法。通过对LAMP扩增体系、反应温度进行优化,及敏感性重复性及特异性试验,结果表明,LAMP的反应温度为63℃,其敏感度可以检测出的最低浓度是10~2copies/μL,并且只能扩增出新孢子虫的基因,证明LAMP检测法具有很高的敏感性及特异性。对重组质粒10~6copies/μL~10~4copies/μL进行3次重复性扩增,每次扩增的时间基本一样,均能扩增出阳性曲线,说明LAMP检测方法具有很好的稳定性。应用建立的新孢子虫PCR检测方法对200份兔脑组织进行检测,其中有14份扩增出NcSRS2基因片段,其阳性率为7%。将新分离的14株新孢子虫基因与已经发表的13株新孢子虫的SRS2基因进行比对分析发现,所有的基因之间的亲缘性都比较近,与最早分离的NC1株的SRS2基因同源性为99%,而JL Rabbit(1/3/6/7/8/10/12/14)SRS2与strain Nc-Liv SRS2的同源性为100%。其他的基因与Nc-Liv SRS2株的基因相比,有个别的碱基发生突变,其中JL Rabbit 2/5/9/13的碱基突变影响了氨基酸翻译,其他的基因也有碱基突变,但是不影响翻译成氨基酸。采用新孢子虫VMRD竞争性ELISA检测试剂盒对吉林、山西、山东、河南、新疆、内蒙、青海共1630份牛血清,578份羊血清、200份兔血清进行检测,其中吉林的牛感染新孢子虫阳性率为18.09%,山东15.39%,山西35.94%,河南15.57%,内蒙6.87%,新疆8.75%,青海10.92%;其中羊感染新孢子虫的阳性率分别为吉林为20.71%,山西23.81%,新疆16.31%,青海7.98%;家兔的阳性率为24.5%。