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β地中海贫血主要是由于β-珠蛋白基因缺陷所引起的小细胞低色素性贫血,它是全球最常见的遗传性疾病之一,广泛存在于地中海、中东和东南亚区域。β地贫有很多种突变类型,而β654地贫患者在中国最多,约占中国地贫患者总数的五分之一,其发病机制主要是β-珠蛋白基因第2内含子中第654位核苷酸发生了C→T的突变(βIVS–2–654),从而在mRNA水平发生了异常剪切,产生了无功能的β-珠蛋白多肽,导致α-珠蛋白和β-珠蛋白不平衡,由于血红蛋白的四聚体结构发生改变,红细胞的运氧功能下降;同时过多的α-珠蛋白沉积在红细胞膜表面,从而使红细胞的渗透脆性升高,在血液体循环过程中易受物理性损伤破坏,以致于发生髓内红系无效造血和髓外红系异常生血。在我国,随着婚检制度的取消,地中海贫血患儿的出生率在一段时间内逐年上升,而目前除了加大产前检查的预防力度,并没有有效的方法治疗地中海贫血患者,大多数病人需要终身输血,并结合铁螯合剂进行去铁治疗。由于供氧的不足,同时受到铁质沉积的影响而使患者脏器发生病理性损伤,大多数纯合子地贫患者往往还没有度过美好的青春岁月便如流星般逝去。造血干细胞移植是目前治疗地中海贫血最有成效的方法,但骨髓移植治疗在临床上需要面对三大问题:供体来源、免疫排斥和移植物抗宿主反应。由于主要组织相容性抗原相合的配型不易找到,这就使广大患者只能进行输血治疗。要突破地中海贫血治疗的瓶颈,需要采用新的技术方法对地贫进行更为安全、有效的治疗。早在2000年,研究人员成功地将正常人β-珠蛋白基因导入造血干细胞,随后基因治疗一度成为有望改善地贫症状的重要的技术手段。我们单位则对β地贫进行了长达三十多年的研究,阐明了β654地贫的发病机制,并先后采用羟基脲、地贫小鼠宫内移植造血干细胞、反义RNA结合RNA干扰、以及在受精卵水平导入正常人β-珠蛋白基因等策略对β654地中海贫血小鼠进行了治疗性研究,并得到了良好的治疗效果。上述研究大多局限在产前治疗,如何对地贫患者进行个体化治疗,仍是摆在全球医务工作者面前的一道难题。2006年第一例诱导性多能性干细胞(inducedpluripotentstemcells,ipscell)产生后,各国科学家对ips细胞的研究进入一个白炽化的时代。随后的一年,即有报导用ips细胞治疗镰刀型贫血小鼠获得成功;在2009年,我国科学家首次用四倍体补偿技术制备出了世界上第一只完全由ips细胞来源的小鼠“小小”,证实了ips细胞具有全能性;2012年,我国科学家通过同源重组的方式成功地对地中海贫血患者的ips细胞进行了基因修正,对此ips细胞定向分化成造血干细胞后骨髓移植scid小鼠,体内实验表明,基因修正过的ips细胞能表达正常的人β-珠蛋白基因。所有这些成果极大地振奋了医务工作者和患者对ips细胞治疗地贫的信心。但我们在用ips细胞治疗地贫的研究过程中意识到用自体化ips细胞治疗地贫需要面对三大问题:安全性问题、有效性问题和剂量域值效应的问题。为了客观、合理、综合地分析上述三大问题,我们制备了不同的ips细胞系,包括基因修正过的β654ips细胞(转染携有正常人β-珠蛋白基因的慢病毒载体lbg的β654/lbg细胞)和无任何基因缺陷的正常的hg-ips细胞(红系特异性高表达gfp的hs23-gfp转基因小鼠的ips细胞),我们通过显微操作的方法将这两种ips细胞分别注射进β654小鼠的囊胚,获得β654/lbgips嵌合体小鼠和hg-ips细胞嵌合体小鼠,β654/lbgips嵌合体小鼠包括用icr品系小鼠囊胚制备的chimera-icr嵌合体小鼠和用β654囊胚制备的chimera-654嵌合体小鼠;hg-ips嵌合体小鼠,包括用icr品系小鼠囊胚制备的gfp/icr嵌合体小鼠和用β654囊胚制备的gfp/β654嵌合体小鼠。本课题通过嵌合体模型观察ips细胞对β654地中海贫血小鼠症状的改善情况。我们研究发现,在两种β654/lbgips嵌合体小鼠中,β654/lbgips细胞均能有效分化成血细胞,并表达正常人的β-珠蛋白基因。其中,chimera-icr小鼠没有显现出任何地中海贫血症状,即使β654/lbgips细胞在chimera-icr小鼠体内的嵌合率高达85%以上,血涂片、骨髓涂片、组织病理切片的分析结果和野生型小鼠一样无任何异常,在chimera-icr小鼠中,血液学参数,包括红细胞计数,平均红细胞体积,平均红细胞血红蛋白浓度均呈正常血像,脾脏也没有肿大现象,说明在β654/lbgips细胞水平,外源性的人β-珠蛋白基因能够有效地补偿β654地贫缺陷基因的功能。通过对血液中红细胞的rt-pcr分析,正常人的β珠蛋白基因和异常剪切的β珠蛋白基因的表达量的比值在chimera-654嵌合体小鼠中并不均一,β654/lbgips细胞的嵌合率越高,比值越高。在chimera-654嵌合体小鼠中,当β654/lbgips细胞的嵌合率在8-16%时,脾脏大小和血液学指标仍呈现出典型的地中海贫血的病理症状,而当β654/lbgips细胞的嵌合率超过30%时,脾脏体重比和网织红细胞的百分比明显下降,血红蛋白水平和红细胞计数水平明显上升。上述实验结果表明,只有当β654/lbgips细胞的嵌合率达到一定程度,外源性正常人的β-珠蛋白基因才能对抗β654地贫的缺陷基因,发挥有效基因的功能性补偿作用,地贫症状才能得到有效的改善,在个体水平客观合理地评估ips细胞治疗的安全性、有效性问题,并分析ips有效治疗的剂量域值效应。与此同时,我们研究正常基因型小鼠hg-ips细胞对地贫症状的改善情况,我们选择hg-ips细胞的嵌合率在10~30%的嵌合体小鼠,观察在低嵌合率小鼠中,hg-ips细胞对地中海贫血的改善情况。我们同样发现,hg-ips细胞在嵌合体小鼠体内能有效分化成血细胞。β654地中海贫血的病理特征,包括肝脏和脾脏的铁质沉积现象,脾脏肿大,小细胞低色素性贫血等症状均有明显的改善。与β654-地中海贫血小鼠比较,血红蛋白浓度(hgb)(123.13±11.91g/l,p<0.01),平均红细胞血红蛋白浓度(mchc)(314.41±11.41g/l,p<0.01)在嵌合体小鼠中明显上升。上述结果表明,hg-ips细胞在较低嵌合状态的情况下能有效治疗β654-地中海贫血。通过嵌合体模型,证实β654/lbg细胞和hg-ips细胞在体内均能有效分化成血细胞,均能有效改善β654地中海贫血的症状。但同时我们也看到,hg-ips细胞能在较低剂量(嵌合率在10~30%)的情况下达到较好的治疗效果,chimera-654嵌合体鼠在低嵌合率时,呈现典型的地贫症状,只有当嵌合率高于30%时,才能有效地治疗地中海贫血,这主要是由于β654/lbg细胞中仍然存在致病缺陷基因,只有当嵌合率达到一定程度,外源性正常人的β珠蛋白基因的表达水平才能达到治疗的域值效应。本课题通过嵌合体小鼠模型证实了ips细胞在体内能够有效地分化成血细胞,对β654地中海贫血的缺陷基因起到了明显的功能性补偿作用,并且这种作用是安全的,未发现其它病理症状。但用iPS细胞治疗地贫,尤其是自体iPS细胞的基因修正性治疗需要考虑到剂量域值效应,这直接关系到iPS细胞临床应用的成与败,这同样也是对科研工作者需要面对的一个巨大的挑战。