前言:胃蛋白酶原C（Pepsinogen C,PGC）是由胃内主细胞分泌的一种天冬氨酸蛋白酶,在胃内的酸性条件下激活为有活性的胃蛋白酶C而具有消化胃内蛋白质的功能。编码PGC蛋白的人PGC基因定位于6p21.1,完整的人PGC基因共含9个外显子和8个内含子,全长10.7kb。PGC蛋白出现于胚胎发育晚期,主要表达于胃部,是胃粘膜细胞分化成熟的终末产物,是消化功能逐渐成熟的标志。PGC在正常胃粘膜是高表达的,发生胃癌时表达下降或缺失。目前已经明确PGC表达与胃癌显著负相关,具体调控机制尚不清楚。另有研究表明,虽然在人体PGC的表达主要存在于胃部,但是一些原本不表达PGC的胃外器官中都能或多或少的检测到PGC的异常表达,特别是在发生肿瘤时PGC异常升高并与肿瘤预后相关,例如前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌等,提示PGC基因可能与多种肿瘤密切相关,尤其是激素相关肿瘤。目前PGC在全肿瘤表达的表达情况及其与不同肿瘤风险及预后的关系尚不清楚;其自身结构的遗传变异及其与表达的内在联系尚不知晓;基于PG基因多组学差异变化与肿瘤临床表型特征的关系尚未阐释;激素与PGC表达的关系及其调控机制尚不清楚。上述关键科学问题有待于深入挖掘与探索。肿瘤和癌症基因图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）已被人们所熟知及广泛应用。在此基础上,其收官之作---泛癌症图谱“Pan-Cancer Atlas”泛癌症图谱对TCGA基因组测序,转录组测序,甲基化等表观组学测序结果进行了多组学整合分析并将其与临床表观和影像检查数据进行关联性对比,在肿瘤细胞起源（Cell-of-Origin Patterns）、致癌过程（Oncogenic Processes）以及癌症信号通路（Signaling Pathways）等方面做了精辟的总结分析,为我们如何从分子特征角度对癌症进行研究提供了可借鉴的思路。研究结果提示,在TCGA肿瘤样品中全面综合的纵向分析某种分子事件在多种肿瘤中的全景图,能够识别多种人类癌症之间的分子关系特别是挖掘临床可操作的癌症驱动事件,可为探索癌症综合治疗的临床可行性,开发靶向和联合治疗新疗法提供新见解。目前,同一基因的多组学泛癌分析越来越引起重视,其不仅有助于发现肿瘤共性表型特征而且有助于深层次解读关键分子事件的成因及自身内在的调控机制。综上,本研究首先通过分析来自癌症基因组图谱（TCGA）的包括33种癌症在内的多层次数据,全景式揭示PGC基因的表达、突变和拷贝数变异及其预后潜力与全肿瘤的关系,以期阐明PGC基因在肿瘤发生发展过程中的重要作用及可能的调控机制。在此基础上,聚焦与PGC表达有密切关系的胃癌,结合我们自行设计的胃癌细胞PGC过表达芯片并利用体内体外实验,深入探讨PGC基因表达对胃癌细胞生物学行为的影响及相关通路,以期明确PGC表达调控机制,特别是激素调控的作用。本研究有助于发现PGC分子分型-表型特征肿瘤,有助于深层次解读PGC异常表达的成因及自身内在的调控机制,有助于开发以PGC为靶点的相关肿瘤的靶向治疗。目的:1.探讨PGC基因的表达、突变和拷贝数变异及其预后潜力与全肿瘤的关系,以期阐明PGC基因在肿瘤发生发展过程中的重要作用及可能的调控网络。2.探讨PGC基因表达对胃癌细胞生物学行为的影响及相关通路,以期明确PGC表达调控机制,特别是激素调控的作用。研究方法:第一部分胃蛋白酶原C基因表达特征及遗传变异泛癌分析1.TCGA33种肿瘤的全基因组组学数据和部分蛋白组学数据采集本研究采集的数据基于TCGA研究网络（http://cancergenome.nih.gov/）.)生成的组学数据集。我们总共分析了全部33个不同特定的癌症类型。所有TCGA数据包括TPM（每千碱基百万转录本）表达、拷贝数变异、突变和临床信息（生存状态、分期、分级、生存时间）均从UCSC Xena下载。PG基因的蛋白表达数据从蛋白质图谱数据集（https://www.proteinatlas.org/）.)获得。2.PGC基因表达相关参数泛癌分析2.1.PGC基因表达特征泛癌分析使用R语言中的Deseq2软件包来识别差异表达的PGC基因。调整后的（adjusted）P值<0.05和至少2倍表达变化（|logFC|≥2）的基因被鉴定为在每种癌症类型中差异表达的PGC基因。采用癌细胞系百科全书（Cancer Cell Line Encyclopedia,CCLE）中覆盖的细胞系进行分析。根据不同细胞系的注释分成不同的癌症类型,包括来自6种癌症类型的43 1个细胞系。不同类型肿瘤细胞系的PGC基因表达情况比较采用Kruskal-Wallis秩和检验。PGC基因表达与肿瘤患者预后的关联分析根据每个PGC基因表达的中位数将TCGA数据库中所有肿瘤患者分为两组。两组生存率比较采用对数秩和检验。P值<0.05为有统计学意义。3.PCG基因突变及拷贝数变异泛癌分析3.1.PGC基因突变泛癌分析PGC基因的突变数据均来源于TCGA和CCLE数据库。PGC基因在每种肿瘤组织和细胞系类型中的突变频率定义为其突变比例。3.2.PGC基因拷贝数变异泛癌分析从TCGA和CCLE数据库下载的PGC基因拷贝数变异（Copy number variation,CNV）数据。以CNV扩增和缺失的比例来计算CNV在每种癌症类型中出现的频率。3.3.PGC基因突变及拷贝数变异与PGC基因表达相关性分析PGC基因家族突变及拷贝数变异与PGC基因表达相关性使用R语言中的Mann-Whitney U检验进行分析。第二部分PGC基因表达泛癌调控网络构建及验证1.PGC基因表达相关信号转导通路泛癌分析采用基因集变异分析（Gene Set Variation Analysis,GSVA）计算PGC基因表达相关通路的活性。利用Pearson Correlation Coefficient,PCC法计算PGC基因表达与通路活性激活之间的皮尔逊相关系数。|PCC|>0.3和调整后的P值<0.05的调控通路被鉴定为显著相关的PGC基因。2.PGC基因表达与免疫相关基因的关联分析利用Spearman相关系数（SCC）计算PGC基因表达与免疫相关基因之间的相关性。|SCC|>0.3和调整后的P值<0.05的调控通路被鉴定为显著相关的PGC基因。3.胃癌细胞PGC基因过表达谱芯片制备及分析3.1.过表达PGC基因及对照组胃癌细胞（AGS）制备利用慢病毒转染技术构建PGC基因过表达的胃癌细胞系。3.2.Affymetrix基因表达谱芯片实验流程总 RNA 样品通过 agilent 2100 分析后,采用 GeneChip 3’IVT Express Kit 制备aRNA（amplified RNA）。即通过一链合成得到cDNA,进一步经过二链合成得到双链DNA模板,然后通过体外反转获得带生物素标记的aRNA（amplified RNA）。将aRNA进行纯化,然后将其片段化后与芯片探针杂交。杂交完成后,对芯片进行洗染,最后扫描得到图片和原始数据。3.3.Affymetrix基因表达谱芯片分析利用R语言进行基因富集分析（Gene Set Enrichment Analysis,GSEA）分析表达谱芯片RNA测序结果的基因表达矩阵,比较过表达PGC过表达组与对照组的之间每个基因的差异并按照差异大小,根据差异程度大小和在某些基因集中的富集程度来计算geneset富集分数并绘图。第三部分雄激素调控PGC基因表达对胃癌细胞生物学行为的影响1.雄激素刺激实验1.1.细胞接种后48小时,处于对数生长期。每孔加入相应DHT药物进行稀释,以达到药物目标终浓度0.1uM、1uM、10uM。分别培养6h、12h、24h、48h,每个时间段均配有阴性对照组（含1640培养液不含DHT）。1.2.到达刺激时间后,收集细胞及培养基至离心管,4度离心1000转5min,弃上清,细胞沉淀收集至离心管冻存备用。1.3.细胞总RNA提取及反转录cDNA:按照Trizol试剂说明书提取细胞总RNA;反转cDNA根据TAKARA反转试剂盒说明书2.CCK-8 实验2.1.接种细胞:用含10%胎小牛血清的培养液配成单个细胞悬液,分为DHT刺激组和对照组。2.2.以每孔5000个细胞接种到96孔板,,每个样品设3个复孔。2.3.培养细胞:将细胞培养皿移入C02培养箱,在37度,5%CO2环境下培养。2.4.分别于24h、48h、72h后,每孔加CCK-8试剂10ul。2.5.在37度,5%CO2培养箱继续孵育1h后,终止培养。选择450nm波长,在酶标仪上测定各孔光吸收值,记录结果,以时间为横坐标,吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。3.Transwell小室体外迁移实验3.1.单细胞悬液制备:取对数生长期的细胞,分别用0.25%胰酶1ml消化,含血清的1640塔养液终止消化,吹打均匀,1000rpm离心5min:弃上清,分别加如如无血清的1640培养液3ml,吹打成均匀的单细胞悬液。（分为DHT刺激组和无刺激对照组）。3.2.迁移实验:在24孔板加入500ul含10%胎牛血清的1640培养液作为趋化剂,Transwell小室置于24孔板上,注意无气泡,内室加入单细胞悬液300u1（5*105/孔）,将24孔板置于37度,5%CO2的培养箱中培养24-48h.取出Transwell小室,弃去培养液,用棉签擦去微孔膜上层的细胞,室温下用95%的乙醇固定10min,PBS洗3次。3.3.1%结晶紫染色5min,在倒置显微镜下计数穿膜的细胞数。每组细胞设3个复孔,每孔随机计数5个高倍视野（400倍）共15个,求其平均值,以穿膜的肿瘤细胞数目多少作为评价其侵袭力强弱的指标。4.qPCR检测分化相关基因的表达4.1.目的基因引物设计:利用NCBI设计分化相关指标的目的基因的引物序列并检验引物的特异性。4.2.qPCR反应:以细胞cDNA为模板,qPCR扩增PGC和相关分化指标基因,每个样本设3个复孔。结果:第一部分胃蛋白酶原C基因表达特征及遗传变异泛癌分析1.PGC基因在某些肿瘤组织中高表达,包括:胆管癌、结肠癌、直肠癌、子宫内膜癌、膀胱尿路上皮癌和乳腺癌;在某些肿瘤组织中低表达,包括:胃癌、肾透明细胞癌、前列腺癌、肺鳞癌和食管癌。2.PGC基因在不同肿瘤类型中与病理参数肿瘤大小T分期、远处转移M分期、有无淋巴结转移N分期有关:在胆管癌、食管癌、肺腺癌、肺鳞癌、直肠癌、胃癌、睾丸生殖细胞肿瘤中,T12期vs T34期、M0 vs M1、NO vs N1均存在PGC表达的差异。其中胆管癌、食管癌、肺鳞癌、肺腺癌、直肠癌和胃癌中,PGC高表达均于T12期相关。在食管癌、直肠癌、胃癌和睾丸生殖细胞肿瘤中与淋巴结转移相关。在胆管癌、食管癌、肺鳞癌、直肠癌、胃癌和睾丸生殖细胞肿瘤,与远处转移相关。3.PGC基因表达与不同类型肿瘤的预后不同。PGC在脑胶质瘤（LGG）和皮肤黑色素瘤（SKCM）中,与肿瘤患者生存率较差相关:在肾透明细胞癌（KIRC）,急性粒细胞白血病（LAML）,间皮瘤（MESO）葡萄膜黑色素瘤（UVM）中,与肿瘤患者生存率较高相关。4.PGC基因在子宫内膜癌和胃癌中经常发生突变。总体平均突变率为0%-5.3%。PGC的基因突变在各个类型肿瘤中均不影响其表达。PGC基因在各种肿瘤类型中显示出广泛的拷贝数扩增,仅在肾嫌色细胞癌（KICH）中显示拷贝数减少。PGC基因的拷贝数对PGC基因表达的影响包括,在胆管癌,食管癌和肾乳头状细胞癌中PGC基因表达随着拷贝数的增加而上调;而在胃癌中,PGC基因拷贝数增加和缺失均能上调PGC基因表达。第二部分PGC基因表达泛癌调控网络构建及验证1.PGC基因参与的肿瘤相关调控网络通路共有33条,主要分布在胃癌、食管癌和肺鳞癌三个肿瘤中。其中显著差异的通路包括K-RAS信号通路、胆汁酸代谢通路、雄激素反应、凝血过程、雌激素反应等。与PGC基因较相关的免疫细胞包括B细胞、肥大细胞、滤泡辅助性T细胞（TFH细胞）和树突状细胞等。2.过表达PGC的胃癌细胞上调基因为166个,下调基因为84个。差异基因相关的肿瘤信号通路主要有:苯丙氨酸、精氨酸、脯氨酸、酪氨酸等氨基酸代谢、错配修复、皮质醇合成与分泌、炎症性肠病、自噬、氧化磷酸化、转录失调等。第三部分雄激素调控PGC基因表达对胃癌细胞生物学行为的影响1.雄激素DHT作用后,可以上调胃癌细胞PGC基因表达水平。2.雄激素刺激胃癌细胞后PGC基因表达同步升高并抑制肿瘤细胞的增殖和迁移。3.雄激素作用后,可以上调胃癌细胞MUC5AC、MUC6和TFF2的表达,促进胃癌细胞分化。结论:1.PGC基因在胆管癌、结肠癌、直肠癌、子宫内膜癌、膀胱尿路上皮癌和乳腺癌中呈高表达,在胃癌、肾透明细胞癌、前列腺癌、肺鳞癌和食管癌中呈低表达。在胃癌、直肠癌、肺鳞癌、肺腺癌、胆管癌、食管癌和睾丸生殖细胞瘤中,PGC基因表达影响肿瘤的T/N/M分期。PGC在脑胶质瘤和皮肤黑色素瘤中,与肿瘤患者生存率较差相关,在肾透明细胞癌,急性粒细胞白血病,间皮瘤和葡萄膜黑色素瘤中,与肿瘤患者生存率较高相关。2.PGC基因在子宫内膜癌和胃癌中经常发生突变并且在各种肿瘤类型中显示出广泛的拷贝数扩增,仅在肾嫌色细胞癌中显示拷贝数减少。在胆管癌,食管癌和肾乳头状细胞癌中PGC基因表达随着拷贝数的增加而上调;而在胃癌中,PGC基因拷贝数增加和缺失的情况下,PGC基因表达均上调。3.PGC基因参与的肿瘤相关调控网络通路主要分布在胃癌、食管癌和肺鳞癌三个肿瘤中,包括:K-RAS信号通路、胆汁酸代谢通路、雄激素反应、凝血过程、雌激素反应等。4.胃癌细胞PGC基因过表达可引起上调基因为166个,下调基因为84个。差异基因相关的肿瘤信号通路主要有:苯丙氨酸、精氨酸、脯氨酸、酪氨酸等氨基酸代谢、错配修复、皮质醇合成与分泌、炎症性肠病、自噬、氧化磷酸化、转录失调等。5.雄激素可以上调胃癌细胞PGC基因表达。雄激素刺激胃癌细胞后PGC基因表达同步升高并抑制肿瘤细胞的增殖和迁移,同时上调MUC5AC、MUC6和TFF2的表达,促进胃癌细胞分化。