论文部分内容阅读
目的:DICER作为mi RNA成熟过程中的关键酶,其功能复杂,与肿瘤的关系密切。本研究旨在明确DICER在放化疗所致的DNA损伤反应中的作用并进行机制上的探讨。方法:人成纤维细胞MRC5SV,宫颈癌细胞He La,人胶质瘤细胞M059J(ATM低表达、DNA-PKcs表达缺失存在NHEJ缺陷),ATM-/-(HRR缺陷细胞),180BRM(Ligase4突变的NHEJ缺陷细胞),将上述细胞应用si RNA技术敲除DICER,经CPT处理,克隆形成实验观察Si DICER对CPT敏感性变化及上述细胞敲除DICER后对射线的敏感性变化。Western Blot检测了DICER敲除后电离辐射HRR通路的关键蛋白:磷酸化ATM、Rad51、Rad54、XRCC2和XRCC3,NHEJ通路的关键蛋白:磷酸化DNA-PKcs,Artemis,Ku70,Lig4和XRCC4的表达情况。MRC5SV和He La细胞敲除DICER后,2Gy电离辐射后不同时间点ATM的磷酸化水平及Foci形成情况。Micro RNA array检测MRC5SV DICER敲除前后mi RNA的表达变化。流式细胞术检测DICER敲除前后细胞周期变化。Western Blot检测细胞周期调控关键蛋白Cyclin E、Cyclin A、Cyclin D1、p21Waf1/Cip1/p27Kip1的表达情况。Real-Time PCR检测DICER敲除前后p21/p27m RNA的表达情况。荧光素酶检测p21和p27 3’UTR是否存在Let-7b的潜在作用位点。U2OS HRR reporter cells及293FT NHEJ reporter cells分别检测DICER敲除后HRR及NHEJ修复效率。结果:(1)DICER敲除致使细胞对CPT抵抗敲除DICER使MRC5SV、He La细胞对CPT抗拒。进一步行恢复实验,即内源性DICER敲除后,将Si RNA抵抗的FLAG标签的DICER转入细胞中,发现对CPT的敏感性恢复。这些结果有力的证实DICER缺陷是细胞对CPT抗拒的主要原因。此外,其他细胞株:ATM-/-、180BRM、M059J敲除DICER后均对CPT抗拒。(2)DICER敲除使p21 Waf1/Cip1/p27 Kip1表达增加介导G1/S期阻滞敲除DICER后引起细胞数下降。G1期细胞对CPT更抗拒,我们检测敲除DICER后对细胞周期的影响。敲除DICER后,在CPT处理的细胞中可介导G1/S阻滞。进一步检测了调节细胞周期的相关基因表达,敲除DICER后p21 Waf1/Cip1/p27Kip1、Cyclin E及Cyclin A的表达明显增高,而敲除p21 Waf1/Cip1/p27Kip1后Cyclin E及Cyclin A的表达下降,表明Cyclin E及Cyclin A的表达依赖于p21 Waf1/Cip1/p27Kip1的存在。更重要的是,敲除DICER后,在CPT处理的细胞中介导的G1/S阻滞,如敲除p21 Waf1/Cip1/p27Kip1,G1/S阻滞消失,表明敲除DICER后,在CPT处理的细胞中介导的G1/S阻滞是由于p21和p27表达增加所致。(3)DICER依赖的Let-7合成减少致使p21 Waf1/Cip1/p27 Kip1表达增高敲除DICER后细胞p21和p27 m RNA水平无改变,但蛋白水平明显升高,表明p21和p27水平增高发生在转录后阶段。比较了人MRC5SV敲除DICER前后mi RNA表达变化,发现敲除DICER后Let-7家族合成明显减少。而Let-7b处理后的细胞p21和p27的表达水平明显下降,表明p21和p27是Let-7的靶基因。p21和p27 3’UTR存在Let-7的潜在作用位点,荧光素酶报告检测表明当细胞转染对照RNA时,荧光素酶活性无变化,但当细胞转染Let-7b时,荧光素酶活性严重受抑制,然而当p21和p27 3’UTR Let-7b结合位点突变时这种抑制作用可被逆转。除Let-7b外,人Let-7家族其他成员,都可以调控p21和p27,表明Let-7家族通过调控p21和p27来调节细胞周期。敲除DICER后过表达Let-7b,G1/S阻滞现象消失。(4)DICER敲除不影响细胞的放射敏感性将人M059J、180BRM、MRC5SV和He La细胞分别分别给予Ct RNA和Si DICER处理,分别给予X射线照射后,其生存率无变化。鼠细胞系,Ku80+/+(野生型)和Ku80-/-(NHEJ缺陷)也得出了相同的结果。DICER敲除后电离辐射HRR通路的关键蛋白:磷酸化ATM、Rad51、Rad54、XRCC2和XRCC3,NHEJ通路的关键蛋白:磷酸化DNA-PKcs、Artemis、Ku70、Lig4和XRCC4的表达未见明显变化。MRC5SV和He La细胞敲除DICER后,给予2Gy电离辐射后不同时间点ATM的磷酸化水平及Foci形成情况与对照组无差异。这排除了敲除DICER介导的CPT抵抗与ATM蛋白水平或活性变化的可能。(5)G1/S期阻滞致使HRR效率下降,S期细胞数目减少,细胞对CPT耐药DICER敲除后我们将Let-7b过表达或抑制p21/p27,DICER敲除的细胞对CPT的耐药消失。HR reporter试验显示,敲除DCIER后,HR修复效率降低,当转染Let-7b或抑制p21和p27的表达,DICER敲除所致的HRR效率下降这一现象即被逆转。NHEJ reporter细胞株敲除DICER后其NHEJ效率增加,而敲除p21或Let-7b上调后增加的NHEJ效率消失。这些结果充分证明DICER敲除所致的HRR效率下降是由于DICER敲除后Let-7合成下降,致使p21/p27过表达,G1/S期阻滞,进入S期减少是细胞对CPT耐药的主因。结论:(1)DICER依赖的Let-7合成减少致使p21 Waf1/Cip1/p27 Kip1表达增高,介导细胞周期G1/S阻滞,致使细胞对CPT抵抗。(2)肿瘤细胞DICER缺乏,通过上述机制介导对S期周期特异性化疗药耐药,是拓扑异构酶I耐药的新机制。(3)DICER敲除不影响细胞的放射敏感性。综上所述,本研究明确了DICER在放化疗所致的DDR中的作用,发现了新的调控细胞周期的mi RNA,且揭示了DICER介导的拓扑异构酶I耐药的新机制,为mi RNA功能和机制的研究提供新的视角。该研究提示DICER在肿瘤的治疗中有非常重要的地位,可能为根据DICER的表达情况开展肿瘤个性化治疗方案提供依据。