急性肺血栓栓塞症(Acute pulmonary thromboembolism,APTE)是指来自体静脉系统或右心的血栓栓子阻塞肺动脉主干或肺动脉分支所致的病理生理综合征,临床上以循环和呼吸功能障碍为主要表现。目前,由于人口老龄化、高龄患者住院比例增加,致使该病的发病率呈增高趋势,而有效诊治手段的不足和突发病例所致的严重后果,导致APTE已成为威胁健康的高危疾病。欧洲心脏病学会(ESC)2008年发布的新版急性肺栓塞诊治指南和美国心脏学会(AHA)于2011年公布的重度肺血栓栓塞治疗指南建议依据临床特征、右心功能不全表现及心肌损伤标志物为分层指标,将急性肺栓塞划分为高、中、低三个危险类型,并推荐高危患者可以行快速溶栓或栓子取出术,中危患者建议住院治疗,低危患者建议院外治疗。溶栓治疗已然成为临床治疗高危急性肺栓塞的主要方法,然而临床实践发现接受规范溶栓治疗的高危急性肺栓塞患者的病死率及猝死率较未溶栓治疗的高危患者并未降低,进一步研究发现这种现象可能与肺血栓栓塞症溶栓治疗早期产生肺缺血/再灌注损伤有关。近年人们在寻求器官缺血/再灌注损伤保护措施的过程中,发现了远端肢体缺血期处理(Remote limbs ischemic perconditioning,RLIPerC)对靶器官的保护现象。远端肢体缺血期处理是指在靶器官缺血期给予远端肢体多次短暂、重复性缺血/再灌注处理,可以明显降低靶器官缺血再灌注损伤,给靶器官提供保护作用。这方面研究早期见于心脏和大脑,目前,该研究已逐步推广到肝脏、肾脏等重要脏器的保护作用。但是,远端肢体缺血期处理对肺血栓栓塞症患者溶栓治疗后的肺缺血／再灌注损伤方面的研究较少。本研究试图通过建立兔APTE模型并在模型建成后,进行肺栓塞溶栓治疗,并在溶栓前进行缺血期肢体缺血处理干预,通过观察溶栓后机体血流动力学变化、炎性因子含量变化以及病理学变化,以期探讨缺血期肢体缺血处理对兔急性肺栓塞模型溶栓后肺缺血/再灌注损伤的保护作用,并对其保护机制进行初步探讨。本研究分以下三个部分完成。第一部分兔急性肺血栓栓塞动物模型的建立目的：建立兔自体血凝块急性肺血栓栓塞动物模型方法：1.动物分组：SPF级健康日本大耳白兔,12只,雌雄不拘,体质量2.0±0.5kg,随机分为2组,每组6只,即假手术组(Sham组)、肺栓塞组(PE组)。PE组：经右心室导管注入自体血凝块栓子。Sham组：经右心室导管注入等量无菌生理盐水,4h后在麻醉状态下放血处死动物。2.兔自体血凝块APTE模型的建立：术前禁食8h,禁水4h。麻醉采用10%水合氯醛腹腔注射(4m1/kg),麻醉满意后,颈部皮肤去毛、消毒,行气管切开插管,连接小动物呼吸机辅助通气,呼吸参数设置为Fi02=0.21,呼吸频率50次／分,潮气量l0ml/kg,吸气呼气比为1：2,生理监测仪监测心率、体温、右心室收缩压力等参数。游离右侧颈静脉,经右侧颈静脉置入右心室测压管,插管进入右心室时有明显突破感,继而根据右心室收缩压波形判断导管的正确位置。经右心室导管抽取2m1静脉血置于无菌注射器内,待自然凝固备用。随后经右心室导管注入常温肝素生理盐水3mg/kg(lmg/ml),连接右心室导管与压力换能器,监测右心室收缩压。游离左侧颈总动脉,置入24G留置导管。待自体血凝块充分凝固后,利用刀片切割自体血凝块,制备长条形栓子,生理盐水冲洗后浸泡于常温生理盐水中备用。经右心室导管注入含兔自体血凝块栓子的无菌生理盐水5m1,制作兔APTE模型。3.检测指标及方法：(1)右心室收缩压测定：术中采用生理检测仪记录栓塞前、栓塞后1h、2h、4h时间点的右心室收缩压。(2)肺组织湿/干(W/D)比值：栓塞4h后在麻醉状态下快速放血法处死实验动物,取左上肺组织约1g,吸干肺表面水分,称得湿重,然后将肺组织置于80℃鼓风干燥箱内烘烤48h,称得干重,计算W/D比值。(3)肺组织MDA含量及SOD活性测定：实验结束后,取左下肺组织与生理盐水按1：9混合,制备肺组织匀浆,在4℃环境下以3000r/ min的速度离心20min,取上清液,采用黄嘌呤氧化酶法和硫代巴比妥酸法测定MDA含量及SOD活性。(4)肺组织病理学检查：术毕,取右上肺组织置入4%多聚甲醛溶液中固定48-72h,乙醇梯度脱水后,利用二甲苯置换出酒精,石蜡包埋,常规切取切片,厚4μm,苏木精-伊红(HE)染色,制片,100倍光镜下观察肺组织损伤情况,参照文献标准,选择肺泡塌陷、出血、白细胞浸润、肺泡壁增厚等四个参数,按正常、轻度、中度、重度、极重分别为0、1、2、3、4分,各项参数评分之和为急性肺损伤评分。4.统计学方法：应用SPSS 20.0统计软件分析,计量数据采用均数±标准差(x±s)表示,数据处理先行方差齐性检验,方差齐者再采用两独立样本t检验,P<0.05认为有统计学意义,保留3位小数。结果：(1)右心室收缩压变化：经方差齐性检验认为具有齐性,经独立样本t检验分析认为,栓塞前组间差异无统计学意义(t=0.681,P=0.511)。经单个重复测量因素方差分析,两组右心室收缩压的变化差异有统计学意义(F=245.516,P=0.000),且两组不同时间点间的差异均有统计学意义(F=42.734,P=0.000)；栓塞后1h,PE组右心室收缩压明显高于Sham组(20.67±1.21mmHg vs 10.50 ±1.05mmHg, t1h=-15.544, P=0.000)。栓塞后2h,PE组右心室收缩压高于Sham组(20.50±0.55mmHg vs 9.83±1.94mmHg,t2h=-12.956,P=0.000)。栓塞后4h,PE组右心室收缩压高于Sham组(20.33±1.37mmHg vs 9.83±1.47mmHg, t4h=-12.807,p=-0.000).(2)肺组织W/D比值变化：经方差齐性检验认为具有齐性(F=0.066,P=0.802),经独立样本t检验分析,PE组与Sham组W/D比值比较差异有统计学意义(t=-6.340,P=0.000),且PE组W/D比值较Sham组增加(4.79±0.23 vs 4.01±0.19,P=0.000)。(3)肺组织MDA含量及SOD活性：经方差齐性检验认为具有齐性(F=4.591,P=0.058),经独立样本t检验分析认为PE组与Sham组MDA比较差异有统计学意义(t=-10.550,P=0.000),且PE组MDA含量较Sham组增加(3.49±0.29nmol/mg VS 2.12±0.12nm01/mg,p=0.000)。经方差齐性检验认为具有齐性(F=0.800,P=0.392),经独立样本t检验分析认为PE组与Sham组SOD活性比较差异有统计学意义(t=10.377,P=0.000),且PE组SOD活性较Sham组降低(127.04±13.52U/mg vs 216.30±16.16U/mg,p=0.000)。(4)肺组织病理学变化：大体标本可见Sham组肺组织正常,肺表面未见出血灶；PE组肺部分不张,表面存在多个散在出血灶,解剖可见肺动脉内有多个血栓块。显微镜下可见Sham组肺组织血管纹路清晰,肺泡壁正常,肺间质未见炎性细胞浸润。PE组多处血栓,血栓表面不光滑,部分血管内血栓成树状分枝,充盈管腔；肺泡壁及间质增厚,间质内可见大量白细胞浸润；肺泡内可见少量红细胞。经方差齐性检验认为方差不齐(F=27.633,P=0.000),经近似t检验分析认为PE组较Sham组ALI评分增加(12.42±0.87 vs 0.89±0.14,P=0.000)。结论：本实验通过右颈静脉注入自体血凝块血栓栓子建立肺血栓栓塞动物模型,模拟临床肺血栓栓塞病人的病理变化,通过监测栓塞后兔右心室收缩压升高、肺组织肺泡-毛细血管屏障功能失调、解剖见肺动脉内有血栓形成等方面可证实兔急性肺血栓栓塞模型造模成功。本法前期预实验期利用10只兔造模,其中8只造模成功,2只因右心功能不全死亡。具有操作简单、重复性好、造模成功率相对较高等优点。第二部分兔急性肺栓塞溶栓后肺缺血/再灌注损伤现象的实验研究目的：观察兔急性肺栓塞溶栓后肺缺血/再灌注损伤的变化方法：1.动物分组：SPF级健康日本大耳白兔,18只,雌雄不拘,体质量(2.0±0.5)kg,随机分为3组,每组6只,即假手术组(Sham组)、肺栓塞组(PE组)、尿激酶组(UK组)。Sham组、PE组同第一部分。UK组：同PE组建立急性肺栓塞模型,在肺栓塞1h后经右心室导管注入尿激酶溶栓,用微量泵2h输注完毕(5万U/kg)。各组均于栓塞4h后,在麻醉状态下快速放血处死动物。2.兔自体血凝块APTE模型的建立：模型制作方法同第一部分。3.检测指标及方法：(1)右心室收缩压测定：术中采用生理检测仪记录栓塞前、栓塞后1h、2h、4h时间点的右心室收缩压。(2)血浆中TNF-α、IL-6含量测定：模型制备成功后,各组分别于栓塞前、栓塞后1h、溶栓后1h、溶栓后2h及溶栓后3h取动脉血2m1,加入无菌EDTA试管中,在4℃环境下以3000r/min的速度离心20min,取上清液,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法测定血清TNF-α、IL-6水平,按照试剂盒说明书操作。(3)肺组织W/D比值：栓塞4h后在麻醉状态下快速放血法处死实验动物,取左上肺组织约1g,吸干肺表面水分,称得湿重,然后将肺组织置于80℃鼓风干燥箱内烘烤48h,称得干重,计算W/D比值。(4)病理学变化：处死动物后,取右上肺组织以4%多聚甲醛固定,石蜡包埋,常规切片,厚4μm,苏木精-伊红(HE)染色,100倍光镜下观察肺组织病理学变化,参照文献标准,选择肺泡塌陷、出血、白细胞浸润、肺泡壁增厚等四个参数分析病理学变化。4.统计学方法：应用SPSS 20.0统计软件分析,计量数据采用均数±标准差(x±s)表示,组间数据比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD-t检验,P<0.05认为有统计学意义,保留3位小数。结果：(1)右心室收缩压变化：经单因素方差分析显示栓塞前各组间差异无统计学意义(F=0.537,P=0.595)；经单个重复测量因素方差分析,各组右心室收缩压的变化差异有统计学意义(F=164.020,P=0.000),各组不同时间点间右心室收缩压的变化差异均有统计学意义(F=106.643,P=0.000)；栓塞后各时间点组间变化差异均有统计学意义h=150.500、F2h=120.903、F4h=83.868,P=0.000),经过LSD-t方法对各组间进行两两比较显示栓塞后1h,PE组、UK组较Sham组右心室收缩压均升高(21.17±1.33mmHg、20.67±1.21mmHg vs 10.50±1.05mmHg,P=0.000),但PE组、UK组间差异无统计学意义(P=0.482)；栓塞后2h,UK组右心室收缩压与PE组无统计学意义(P=0.207)；栓塞后4h,UK组右心室收缩压比PE组降低(17.50±1.52mmHg vs 20.33±1.37mmHg, P=0.004)。(2)血浆中TNF-α、IL-6含量测定：经单个重复测量因素方差分析,各组对TNF-α影响有统计学意义(F=921.233,P=0.000),各组不同时间点间差异均有统计学意义(F=454.285,P=0.000)；经单因素方差分析显示栓塞前组间差异无统计学意义(FTNF-α=0.238,P=0.791)；经过LSD-t方法对各组间进行两两比较显示：栓塞后,PE组TNF-a持续高于Sham组(P<0.05)。溶栓治疗后,UK组TNF-a比PE组增高,差异有统计学意义(P=0.000)。经单个重复测量因素方差分析,各组对IL-6影响有统计学意义(F=181.119,P=0.000),各组不同时间点间差异均有统计学意义(F=115.252,P=0.000)；经单因素方差分析显示栓塞前组间差异无统计学意义(FIL=0.367,P=0.699)；经过LSD-t方法对各组间进行两两比较显示：栓塞后,PE组IL-6持续高于Sham组(P=0.000)。溶栓治疗后,UK组IL-6比PE组增高,差异有统计学意义(P<0.05)。(3)肺组织W/D比值变化：经单因素方差分析显示组间差异比较有统计学意义(F=48.913,P=0.000),经过LSD-t方法对各组间进行两两比较显示PE组W/D比值较Sham组增加(4.79±0.23 vs 4.01±0.19,P<0.05),UK组W/D比值较PE组明显增加(5.29±0.25 vs 4.79±0.23,P<0.05)。(4)肺组织病理学变化：大体标本可见Sham组肺组织正常,肺表面未见出血灶；PE组肺部分不张,表面存在多个散在出血灶,解剖可见肺动脉内有多个血栓块；UK组可见肺表面多个散在出血点,解剖肺动脉内未见血栓块。显微镜下可见Sham组肺组织血管纹路清晰,肺泡壁正常,肺间质未见炎性细胞浸润。PE组多处血栓,血栓表面不光滑,部分血管内血栓成树状分枝,充盈管腔；肺泡壁及间质增厚,间质内可见大量白细胞浸润；肺泡内可见少量红细胞。UK组显微镜下可见少量血栓,血管较通畅；肺泡壁及间质进一步增厚,间质内可见更多的白细胞浸润。结论：在急性肺栓塞后TNF-α及IL-6均有不同程度的增高,而静脉注射尿激酶溶栓治疗后TNF-α及IL-6的水平进一步增高,且溶栓治疗2h后达高峰,肺组织W/D比值变化及病理结果提示急性肺栓塞溶栓治疗后加重了肺组织损伤。第三部分兔急性肺栓塞期肢体缺血处理对溶栓后肺缺血/再灌注损伤的保护作用目的：观察兔急性肺栓塞期肢体缺血处理对兔急性肺血栓栓塞溶栓后肺缺血/再灌注损伤的保护作用方法：1.动物分组：SPF级健康日本大耳白兔,24只,雌雄不拘,体质量(2.0±0.5)kg,随机分为4组,每组6只,即假手术组(Sham组)、肺栓塞组(PE组)、尿激酶组(UK组)、尿激酶+肢体缺血处理组(UK+LIPerC组)。Sham组、PE组、UK组建模同第二部分。UK+LIPerC组：同PE组建立急性肺栓塞模型,在栓塞20min后,利用弹性束带加压至200mmHg,阻断双侧上肢血供5min,不能触及远端肢体动脉搏动为判断标准,释放加压束带压力,恢复双上肢血供再灌注5min,重复进行4次,其余步骤同UK组。各组均于栓塞4h后,在麻醉状态下快速放血处死动物。2.兔自体血凝块APTE模型的建立：模型制作方法同第一部分。3.检测指标及方法：(1)右心室收缩压测定：术中采用生理检测仪记录栓塞前、栓塞后1h、2h、4h时间点的右心室收缩压。(2)肺组织W/D比值：栓塞4h后在麻醉状态下快速放血法处死实验动物,取左上肺组织约1g,吸干肺表面水分,称得湿重,然后将肺组织置于80℃鼓风干燥箱内烘烤48h,称得干重,计算W/D比值。(3)肺组织MDA含量及SOD活性测定：实验结束后,取左下肺组织与生理盐水按1：9混合,制备肺组织匀浆,在4℃环境下以3000r/min的速度离心20min,取上清液,采用黄嘌呤氧化酶法和硫代巴比妥酸法测定MDA含量及SOD活性。(4)肺组织IL-6含量测定：实验结束后,将肺组织与生理盐水按1：9混合,制备肺组织匀浆,在4℃环境下3000r/min离心20min,取上清液,比色法测定肺组织中IL-6含量。(5)肺组织病理学检查：处死动物后,取右上肺组织以4%多聚甲醛固定,石蜡包埋,常规切片,厚4μm,苏木精-伊红(HE)染色,100倍光镜下观察肺组织病理学变化,参照文献标准,选择肺泡塌陷、出血、白细胞浸润、肺泡壁增厚等四个参数进行肺损伤病理学评分。4.统计学方法：应用SPSS 20.0统计软件分析,计量数据采用均数±标准差(x±s)表示,组间数据比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD-t检验,P<0.05认为有统计学意义,保留3位小数。结果：(1)右心室收缩压变化：经单个重复测量因素方差分析,各组右心室收缩压的变化差异有统计学意义(F=-112.316,P=-0.000),各组不同时间点间差异均有统计学意义(F=149.563,P=0.000)；经单因素方差分析显示栓塞前组间差异无统计学意义(F=0.686,P=0.571)；栓塞后各时间点组间差异有统计学意义(f1h=79.733、F2h=76.939、F4h=63.658,P=000),经过LSD-t方法对各组间进行两两比较显示栓塞后1h,PE组、UK组、UK+LIPerC组较Sham组右心室收缩压均升高(10.67±1.2mmHg.21.17±1.33mmHg.19.83±1.83mmHg vs 10.50 ±1.05mmHg,P=0.000),但PE组、UK组及UK+LIPerC组间差异无统计学意义(P均>0.05)；栓塞后2h,UK组右心室收缩压与PE组比较无统计学意义(P=0.215),UK+LIPerC组比UK组降低(17.83±1.47mmHg vs 19.50±1.05mmHg,P=0.046)；栓塞后4h,UK组及UK+LIPerC组右心室收缩压均比PE组降低(17.50±1.52mmHg、 17.00±1.10mmHg vs 20.33±1.37mmHg,P<0.002),但UK组及UK+LIPerC组间差异无统计学意义(P=0.535)。(2)肺组织W/D比值变化：经单因素方差分析显示组间比较差异有统计学意义(F=40.311,P=0.000),经过LSD-t方法对各组间进行两两比较显示UK组比Sham组、PE组W/D比值明显增加(P<0.001):UK+LIPerC组比UK组W/D比值明显降低(4.96±0.15 vs 5.29±0.25,P=0.015)。(3)肺组织MDA含量及SOD活性：经单因素方差分析显示各组间相比,MDA含量(P=188.523,P=0.000).SOD含量(F=110.774,P=0.000)各组间差异有统计学意义,经过LSD-t方法对各组间进行两两比较显示UK组比Sham组、PE组MDA含量显著升高、SOD活性降低(P均=0.000)；UK+LIPerC组比UK组MDA含量显著降低(6.31±0.42nmol/mg vs 8.75±0.91nmol/mg,P=0.000)、SOD活性升高(148.93±14.53U/mg vs 78.69±7.25U/mg,尸<0.01)。(4)肺组织IL-6含量测定：经单因素方差分析显示组间比较差异有统计学意义(F=546.231,P=0.000),经过LSD-t方法对各组间进行两两比较显示UK组比Sham组、PE组IL-6含量显著升高(P=0.000)；UK+LIPerC组比UK组IL-6含量显著降低(0.11±0.04ng/mg vs 0.14±0.04ng/mg,P=0.000).(5)肺大体标本及病理学评分：大体标本可见Sham组肺组织正常,肺表面未见出血灶；PE组肺部分不张,表面存在多个散在出血灶,解剖可见肺动脉内有多个血栓块；UK组及UK+LIPerC组可见肺表面多个散在出血点,解剖肺动脉内未见血栓块。显微镜下可见Sham组肺组织血管纹路清晰,肺泡壁正常,肺间质未见炎性细胞浸润。PE组多处血栓,血栓表面不光滑,部分血管内血栓成树状分枝,充盈管腔；肺泡壁及间质增厚,间质内可见大量白细胞浸润；肺泡内可见少量红细胞。UK组显微镜下可见少量血栓,血管较通畅；肺泡壁及间质进一步增厚,间质内可见更多的白细胞浸润。UK+LIPerC组显微镜下可见少量血栓,血管通畅；肺泡壁及间质较UK组明显变薄,间质内少量白细胞浸润。采用单因素方差分析显示组间比较有差异(F=419.216,P=0.000),经过LSD方法对各组间进行两两比较显示UK组较PE组ALI评分增加(13.83+0.75 vs 12.42+0.87, P=0.002),UK+LIPerC组较UK组ALI评分降低(9.38±0.76 vs 13.83±0.75,P=0.000)。结论：兔急性肺栓塞期肢体缺血处理对兔急性肺血栓栓塞溶栓后的肺缺血/再灌注损伤存在保护作用。LIPerC可以减少溶栓治疗早期的肺缺血/再灌注损伤,抑制肺组织炎症反应、减少肺组织炎性细胞浸润,降低肺毛细血管通透性,减少肺水肿。