利用蛋白芯片进行拟南芥转录因子性质研究

来源 :北京大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:xzy200611519
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本文首先进行了拟南芥转录因子开放阅读框的大规模克隆。一共有1282个转录因子的ORF(开放阅读框)被高通量克隆入pENTR载体(其中有994个克隆由国内其它8个实验室联合完成),其中有411个基因的cDNA是首次被克隆。对这些克隆基因的序列分析表明有34个基因的序列与已被报道的cDNA序列或目前预测的开放阅读框不符合。其中至少五个基因出现了新的可变剪切产物。进一步将全部基因亚克隆入酵母表达载体pYTV。通过筛选由70碱基寡核苷酸组成的DNA芯片,检测了克隆得到的转录因子在17种拟南芥组织器官中的表达情况。使用已克隆的转录因子,从酵母中表达纯化了860个转录因子蛋白并制作了蛋白芯片。利用蛋白芯片研究了AP2/EREBP家族转录因子与感兴趣的DNA顺式元件的相互作用。结果表明AP2/EREBP家族转录因子结合DNA的特异性与它们的DNA结合结构域的相似性是十分一致的。通过比较七个已被报道的此家族转录因子的DNA结合活性和本文中得到的蛋白芯片杂交结果,发现全部七个转录因子在蛋白芯片上都显示了与非蛋白芯片结果基本一致的DNA结合特异性。在蛋白芯片上经纯化和未纯化蛋白质的结合DNA特性没有显著差异。利用芯片筛选傍晚元件(EE)结合转录因子,并发现了几个既能与EE结合又受周期调控表达的转录因子。其中一个叫MybL2的基因受到关注。在这个基因的T—DNA株系中,EE结合蛋白的表达量下降。还研究了转录因子与HY5蛋白和COP1蛋白的相互作用情况,并通过酵母双杂交验证了四个HY5结合转录因子。
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