近些年，具有抗肿瘤生物活性的人工合成多肽受到广泛的关注。随着研究的深入，人们发现许多小肽在抗肿瘤侵袭转移方面有一定的作用，并且以肽为基础的治疗具有高效低毒的优势，还可以增加肿瘤对其他治疗方法的敏感度，对于肿瘤的临床治疗具有重要价值。P-5m八肽来源于高分子量激肽原第五结构域。有报道指出，P-5m八肽在细胞水平能够抑制小鼠黑色素瘤细胞的粘附和侵袭，并能抑制小鼠黑色素瘤肺转移，HGK是其关键模序。尽管我们已明确P-5m参与抑制肿瘤的侵袭转移，但是P-5m八肽在人源肿瘤模型上是否有效尚未见报道，关于P-5m抗肿瘤转移的机制研究在国际上尚属空白。本研究利用人源HCCLM3肝癌细胞，检测了P-5m抑制肿瘤细胞转移的效果，并建立了裸鼠原位肝癌肺转移模型，探讨P-5m抑制肿瘤转移的作用及机制。另外，还检测了P-5m与5-氟尿嘧啶（5-Fu）单独和联合应用对小鼠肝癌腹水瘤生成的影响，为后期药物的研发奠定理论基础。1. P-5m抑制HCCLM3细胞的迁移和侵袭肿瘤细胞的迁移和侵袭是癌转移的两个重要阶段，因此本研究首先利用HCCLM3细胞检测了P-5m对肿瘤细胞迁移和侵袭能力的影响。划痕实验结果显示，P-5m明显抑制HCCLM3细胞的迁移，划线24h后，10μM P-5m处理组划痕面积与对照组无差别，100μM P-5m处理组划痕面积比对照组多20%；划线48h后，10μM P-5m处理组划痕面积比对照组多11.8%，100μM P-5m处理组划痕面积比对照组多19%。根据划痕实验，P-5m对人肝癌细胞迁移的抑制效果较显著，因此在transwell侵袭实验中，我们将HCCLM3和SMMC-7721肝癌细胞的侵袭性进行比较，为体内模型的构建提供依据。SMMC-7721细胞的侵袭实验结果显示，10μM P-5m处理组穿膜细胞数比对照组少23.2%，100μM P-5m处理组穿膜细胞数比对照组少46.4%；HCCLM3细胞的侵袭实验结果显示，10μM P-5m处理组穿膜细胞数比对照组少26.8%，100μM P-5m处理组穿膜细胞数比对照组少40.3%。但从照片可以看到，HCCLM3细胞比SMMC-7721细胞更易穿过基质胶，有更多的细胞穿过膜并附着在小室下面。因此，我们选取肝癌HCCLM3高转移株用于后续的体内外研究。2. P-5m抑制HCCLM3细胞中MMP-2蛋白表达水平有报道称肝癌病人血清基质金属蛋白酶2（MMP-2）表达水平升高，为了检测P-5m能否抑制HCCLM3细胞中MMP-2的分泌水平，本实验用终浓度为1μM、10μM和100μM的P-5m对HCCLM3细胞进行刺激，药物作用时间为36h，此为最佳反应时间。36h后，取细胞培养上清进行酶谱分析检测，上清加样量根据细胞计数个数进行平衡。结果显示，1μM、10μM和100μM的P-5m处理后，加药组MMP-2活性与对照组比较分别减少4.4%、31.7%和52.4%，说明P-5m能够抑制HCCLM3细胞分泌MMP-2。本研究进一步检测了P-5m对HCCLM3细胞中MMP-2的蛋白表达影响，用终浓度为1μM、10μM和100μM的P-5m作用36h后的细胞进行裂解，MMP-2的蛋白表达水平与对照组比较分别减少15.8%、53.6%和66.2%，说明P-5m能够抑制HCCLM3细胞中MMP-2的蛋白表达水平。3. P-5m抑制裸鼠原位肝癌转移模型的肺转移水平本研究进一步在裸鼠原位肝癌转移模型中检测了P-5m对肿瘤转移的治疗作用。由于肝原位移植动物模型能够使移植瘤获得与人肝脏肿瘤相似的微环境，有利于肿瘤恶性表型的体现，因此本项研究利用HCCLM3细胞构建人肝癌裸鼠肝原位移植模型。在实验中5-Fu显示出很大的毒性，该组没有进行统计。我们将各组裸小鼠的肺脏标本进行HE染色，在显微镜下对每组400张切片逐一进行观察，计算转移率。结果显示，50μg/kg P-5m给药组肿瘤肺转移率（2.0%）明显低于对照组（8.1%），而500μg/kg P-5m给药组肿瘤肺转移率（6.8%）与对照组比较无统计学差异（p>0.05）。4. P-5m抑制裸鼠原位肝癌转移模型MMP-2的表达对照组样本MMP-2免疫组化检测显示出明显的深褐色颗粒，分布在细胞的胞浆及胞外基质中，P-5m两个给药组MMP-2免疫组化显色明显弱于对照组，并且50μg/kg P-5m给药组肿瘤局部溶解坏死，很少能看到颗粒状的MMP-2着色，但500μg/kg P-5m给药组显色程度高于50μg/kg P-5m给药组。由于利用免疫组化检测MMP-2蛋白表达属于半定量分析，我们将从肿瘤组织提取的蛋白用于Western Blot分析。Western Blot检测进一步证明50μg/kg P-5m剂量显著降低裸小鼠肝脏肿瘤中MMP-2的表达水平达46.7%，而500μg/kg P-5m剂量组没有这种作用。本研究结果提示P-5m可能通过调节MMP-2表达来抑制肿瘤转移。为了进一步研究P-5m调节肝癌细胞迁移的分子机制，我们比较了P-5m (50μg/kg)处理组与对照组裸鼠肝脏原位瘤基因的表达情况。利用实时定量PCR扩增的24个基因包括降解细胞外基质的相关基因、粘附分子、转移相关标志物、凋亡相关因子、细胞周期调节分子、免疫相关分子等。经实时定量PCR检测的基因的溶解曲线都呈现单峰，说明是特异性扩增。GAPDH基因做内参照。P-5m (50μg/kg)处理组基因表达水平高于对照组3倍或抑制率超过30%被视为有意义。TIMP-1, TIMP-2, CASP-3, MTSS-1, TGF-β1和IL-6六个基因发生上调，并且IL-6上调达13倍以上。MMP-2基因发生下调，进一步证明P-5m能够抑制MMP-2的表达水平。5. P-5m与5-Fu单独及联合应用对H22肝癌小鼠腹水的抑制作用腹腔化疗是治疗恶性腹水的一个有效手段，该方法能够提高腹腔内药物作用浓度并减少毒副作用。本研究给昆明小鼠接种H22肝癌腹水瘤细胞构建腹水模型。结果显示，除P-5m高剂量组外，其余各组与模型对照组比较，体重增加明显减缓。腹水体积计算结果同样表明，联合给药组降低腹水体积最明显（p<0.001），P-5m中剂量组优于低剂量组，P-5m高剂量组对降低腹水体积没有作用（p>0.05）。联合给药组腹水中肿瘤细胞数目显著减少。与模型对照模型组比较，各组生存期均有延长，尤其是联合给药组小鼠生存时间延长最显著，中位生存时间达52.8天，至结束观察时仍有5只小鼠存活，并且体征正常。与模型对照组（17.3天）相比，生存期延长305%。6. P-5m与5-Fu单独及联合应用对H22肝癌小鼠腹水细胞周期和腹膜渗透性的影响通过流式细胞周期检测，我们发现低、中剂量的P-5m能够将H22腹水瘤细胞阻滞在G1期，而5-Fu能够将细胞阻滞在S期。我们向荷瘤鼠的尾静脉注射8%Evans blue荧光染料进行腹膜渗透性实验，用酶标仪检测腹水Evans蓝的吸光度值，可间接反映荷瘤鼠腹膜渗透性。结果发现，5-Fu明显降低小鼠腹膜渗透性。本研究提示P-5m能够增强5-Fu的抗肿瘤作用，由于二者都使用低剂量，能显著降低化疗药物的毒性。综上所述，本研究通过细胞水平和整体水平的实验，检测了P-5m八肽对人源肝癌细胞侵袭转移的影响，并明确了其抑制作用与降低MMP-2表达水平有关。本研究还发现，P-5m与5-Fu联合应用显著抑制H22肝癌模型鼠腹水的生成，降低腹水恶性程度，并显著延长小鼠生存时间。该作用可能与细胞周期阻滞和腹膜渗透性降低有关。可见，本研究为抗肝癌转移和癌症腹腔化疗药物的开发提供了新的思路。