SARS冠状病毒(SARS-CoV)感染所引起的严重急性呼吸综合征(SARS)，2003年冬春之际在我国以及世界上多个国家和地区的爆发流行，对人类健康、经济发展和社会稳定造成了严重的危害。早期、快速、准确的诊断，对于SARS的预防和隔离至关重要。目前常用的诊断措施包括病毒分离培养、免疫学方法、基于PCR的检测技术等等，但分别存在难以早期诊断、敏感度低、实施困难或假阳性高等缺陷。本课题研究采用基因芯片技术，探索对SARS冠状病毒感染的早期、敏感、准确和快速检测。 基因芯片是近年来兴起的基因检测新技术。特别是最近迅速发展的长链寡核苷酸基因芯片技术(60-70 mer Oligo Microarray)，为从基因水平高度特异性的检测SARS-CoV提供了可能。本研究还采用一种全基因组的标记方法，与基因芯片检测的大规模、高通量特性相配合，为基因芯片在临床诊断中的应用做出了贡献。 本研究首先确立了长链寡核苷酸基因芯片实验的基本条件，通过采用几种不同的基质材料进行点样杂交，以获得最适合长链寡核苷酸点样的片基材料以及最适的点样浓度和特异性。进而确定了用于寡核苷酸芯片杂交检测所需要的最佳探针片段长度。 然后根据NCBI网站GENEBANK数据库中SARS-CoV的序列信息，采用生物信息学方法设计了长度为60mer的寡核苷酸作为探针，并对其进行BLAST比对，采用了严格的遴选标准，从中选出特异性高的30条作为探针，点样制备SARS冠状病毒60mer寡核苷酸检测基因芯片，采用vero E6细胞培养的SARS-CoV作为阳性对照样品，采用HepG2细胞总RNA作为阴性对照样品进行对比研究。 通过采用限制性荧光标记技术进行全基因组扩增标记，标记产物纯化后与芯片进行杂交，采用激光共聚焦扫描仪进行扫描，Array-Pro Analyzer软件采集图像并进行图像分析，分别对阳性、阴性对照的样品杂交结果进行分析，进而对探针进行了筛选和最终的确定。 为解决临床样品病毒含量低，以及可能存在的样品污染等问题，本研究对限制性荧光标记技术进行了改进。通过在扩增体系中加入荧光标记的dNTP对样品同时进行两种荧光标记，提高了单位分子标记片段的荧光强度值，并增加了检测的灵敏度。同时，在样品标记过程中还引入了防污染措施，可防止阳性扩增产物污染可能造成的假阳性结果的出现。 通过上述过程制备01190芯片用于中试规模的临床检测，由广东省疾病预防控制中心采集601例临床样品(200例临床确诊患者咽漱液样品，401例临床排除患者以及正常人咽漱液样品)，采用双盲法原则进行检测，对检测结果进行统计学分析，确定临床数据处理方法以及诊断标准，从而对检测结果进行判断以及评估。 本课题通过实验室研究，得到以下实验结果:1.本实验验证结果表明，在多种表面处理物当中，多聚赖氨酸处理的 玻片对于长链的寡核昔酸具有较高的固定率;长链寡核昔酸探针在 浓度为1.0一2.spg/pL范围内固定率较高，且随探针浓度增加而增 加，为进行寡核昔酸芯片实验的最佳选择;全部克隆片段测序结果 表明，60一7Omer的寡核普酸探针具有很高的特异性，60mer合成 的成本更低以及可靠性更有保障，故确定设计采用60mer寡核昔酸 探针检测SARS一CoV。2.通过实验排除了非特异性杂交的探针以及存在空间位阻的探针，最 终确定从30条探针中，选用了12条探针进行临床试验。3.标记方法的改进使得检测的灵敏度得到提高，经改进方法标记的样 品与原标记方法相比，其杂交结果荧光信号强，信噪比高，可以较 好的应用于进一步的临床中试阶段。4.在对新样品加接头后再次引入酶切，可有效的清除可能造成污染的 病毒核酸扩增片段，而新加上接头的样品片段由于有甲基化保护， 不会被降解，从而可以防止临床试验中假阳性结果的产生。5.对200例临床确诊SARS患者咽漱液诊断的灵敏度为71 .50%，401例临床排除以及正常人咽漱液样品诊断的特异度为92.01%。在发病早期(以十天为界)诊断的灵敏度为81.08%，咽漱液样品检出率在发病的第3~8天达到高峰，达到了早期快速诊断的需求。6.研究制备了SARS冠状病毒诊断试剂盒，已呈报国家食品药品管理 局并启动审评过程。 综上所述，基因芯片具有大规模、高通量、高度敏感与高度特异性等特点。采用长链(60一70mer)寡核昔酸作为探针，可以更有效地提高特异性，避免假阳性结果的出现。中试规模的临床试验结果表明，长链寡核昔酸基因芯片在感染性疾病早期快速诊断方面具有优势。在感染性疾病病原体的确定以及进一步的鉴别诊断等方面具有广阔的应用前景。