铁是生物体所必需的微量元素,但同时也具有潜在毒性。持续性铁超载引发的肝纤维化和心肌纤维化是导致铁超载病人发病和死亡的主要原因。目前,对于铁超载诱导的纤维化尚无有效的疗法。去铁胺(Deferoxamine,DFO)为传统的铁鳌合剂,目前临床上普遍采用的驱铁治疗药。但DFO必须经静脉或体腔途径给药,从而导致病人依从性差,且会产生很多不良反应。有大量报道证实,DFO对合并纤维化的铁超载病人无显著疗效。最新研究表明,钙通道是铁进入细胞的主要途径,钙通道阻滞剂能有效地阻断铁进入细胞内,并减少胶原组织蓄积。中药丹参(Salvia miltiorrhiza,SM)为唇形科植物丹参的干燥根和根茎,具有活血祛瘀的功效,还具有抗纤维化、抗氧化、抗炎和抗凋亡等多靶点药理作用。实验研究证实,丹参对心血管系统的保护作用很可能与其阻断细胞膜上的钙通道减少钙内流密切相关。已有研究表明,丹参能够逆转实验性肝纤维化。综上所述,我们认为在铁超载的状态下丹参很可能对脏器具有保护作用。本研究论文利用分子生物学、病理形态学等实验方法和手段,系统并深入地探讨了以下内容:(1)丹参注射液对铁超载斑马鱼保护作用;(2)丹参注射液对铁超载小鼠肝纤维化以及(3)心肌纤维化的防治作用。论文具体内容如下:第一部分 参注射液对铁超载斑马鱼保护作用目的:以斑马鱼为受试动物,研究丹参注射剂对铁超载所致斑马鱼器官损伤的保护作用。方法:以硫酸亚铁溶液制备斑马鱼急性水浴染毒模型,计算不同时间铁超载致斑马鱼急性中毒的半数致死浓度LC50。将80条斑马鱼随机分为正常组、铁超载组、0.96 g/L丹参组、1.28 g/L丹参组、1.60 g/L丹参组和1.92 g/L丹参组。取斑马鱼心脏和肝脏组织匀浆检测氧化应激指标超氧化物歧化酶(SOD)活性、谷胱甘肽(GSH)以及丙二醛(MDA)含量的改变。结果:铁超载斑马鱼24h的LC50为1.54 g/L,48 h、72 h和96 h的LC50均为1.37 g/L。分别加入丹参0.32 g/L、0.64 g/L、0.96 g/L、1.28 g/L、1.60 g/L和1.92 g/L在1.00 g/L的铁溶液中,斑马鱼24 h存活率分别被为0%,20%,50%,100%,100%和100%,96 h存活率则分别被为0%、0%、30%、50%、90%和100%。丹参各浓度组的肝脏和心脏的SOD活性、GSH含量显著高于铁超载组(P<0.5),而MDA含量显著低于铁超载组(P<0.5)。结论:丹参注射液能够有效防治铁超载所致斑马鱼心脏和肝脏的氧化应激性损伤,并且丹参注射液的作用呈剂量依赖性。第二部分 参对铁超载小鼠肝纤维化的多靶点抑制作用的研究目的:以铁超载诱发肝纤维化的小鼠为实验对象,探究丹参对铁超载性肝纤维化的抑制作用及其潜在机制。方法:将60只雄性小鼠随机分为5组,每组12只:正常组(CONT,生理盐水)、慢性铁超载组(CIO,右旋糖酐铁50 mg/kg/day)、低剂量丹参组(L-SM,3 g/kg/day)、高剂量丹参组(H-SM,6 g/kg/day)以及去铁胺组(DFO,100 mg/kg/day)。各组给药方式均采用腹腔注射,L-SM组、H-SM组和DFO组在药物治疗4 h前给予右旋糖酐铁50 mg/kg/day,连续给药7周。丹参注射液的主要成分通过高效液相色谱法进行量化分析。采用常规方法对肝脏内铁分布、羟基脯氨酸(Hyp)含量、SOD活性、GSH以及MDA含量的进行检测。III型胶原和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的蛋白表达水平通过免疫组织化学法进行分析检测。转化生长因子-β1(TGF-β1)、基质金属蛋白酶(MMP-9)以及半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3(caspase-3)通过反转录酶-聚合酶链反应(RT-PCR)检测。肝脏的形态学变化采用石蜡切片通过苏木精伊红染色法(H&E)、普鲁士蓝染色和马松三色法进行观察。结果:(1)利用高效液相色谱法分析,丹参注射液被检测到包含3种主要成分:丹参素、原儿茶醛以及丹酚酸B,其浓度分别为2.15 mg/ml,0.44 mg/ml和1.01 mg/ml。(2)L-SM组以及H-SM组的肝脏系数与CIO组相比分别下降了28.30%和40.81%(P<0.01)。(3)组织切片H&E染色观察显示,给与低剂量和高剂量丹参治疗后,肝脏病变程度明显减轻,肝小叶结构基本恢复正常,肝内血铁黄素沉积、纤维组织和炎细胞明显减少。(4)组织切片普鲁士蓝染色观察显示,与CIO组比较,L-SM组和H-SM组普鲁士蓝阳性染色面积百分比分别减少了约30.61%和53.86%(P<0.01)。(5)组织切片马松三色染色表明,经低剂量和高剂量SM治疗后,与CIO组比较,两治疗组小鼠肝纤维化的阳性染色面积分别降低了约46.50%和89.29%(P<0.01)。(6)与CIO组比较,L-SM组和H-SM组肝脏中III型胶原的阳性表达面积明显降低。(7)与CIO组比较,L-SM组和H-SM组肝脏Hyp含量分别降至0.14±0.01μg/mg和0.13±0.01μg/mg(P<0.05和P<0.01)。(8)与CIO组比较,L-SM组和H-SM组TGF-βm RNA的表达水平分别降低了约23.32%和49.82%(P<0.01),而MMP-9 m RNA表达水平则分别增高了约1.1倍和3.4倍(P<0.01)。(9)L-SM组和H-SM组的SOD活性和GSH含量与CIO组比较明显升高,同时MDA水平显著下降(P<0.05和P<0.01)。(10)与CIO组比较,L-SM组和H-SM组的致炎因子TNF-α蛋白表达水平明显减弱。(11)与CIO组比较,L-SM组和H-SM组的caspase-3 m RNA表达水平分别降低了约18.25%(P<0.05)和32.32%(P<0.01)。结论:丹参对慢性铁超载性肝脏纤维化具有显著的抑制作用,其作用机制可归因于丹参对肝内铁沉积、纤维增生、氧化应激反应、炎症反应以及细胞凋亡的多靶点抑制作用。第三部分参注射液对铁超载小鼠心肌纤维化抑制作用的研究目的:本研究拟探讨丹参注射液治疗小鼠慢性铁超载性心肌纤维化的功效和基本机制。方法:雄性昆明小鼠(8周龄)被随机分成6组,每组10只:正常对照(CONT)组、慢性铁超载组(CIO)、低剂量丹参(L-SM)组、高剂量丹参(H-SM)组、维拉帕米(VRP)组和去铁胺(DFO)组。CONT组只注射等容量的生理盐水。其他五组的小鼠,腹腔注射右旋糖酐铁50mg/kg/day,持续7周,而后四组小鼠给铁4 h后还分别给予丹参3 g/kg/day、丹参6 g/kg/day、维拉帕米100 mg/kg/day和DFO 100mg/kg/day。心脏组织切片进行普鲁士蓝染色检测铁的沉积程度。心肌纤维化的程度由马松三色染色和Hyp定量检测确定。采用比色法测定心肌匀浆组织中SOD活性和MDA含量。应用免疫组织化学法观测I型胶原蛋白(COL I)和III型胶原蛋白(COL III)在心肌组织中的表达程度。应用Western blotting法检测TGF-β1和MMP-9的蛋白表达水平。结果:(1)L-SM组和H-SM组的心脏系数与CIO组相比分别降低了16.08%和18.47%(P<0.01)。(2)H&E切片染色观察显示,给与低剂量或高剂量丹参治疗后,组织学变化水平显著改善,表现为心肌细胞排列规则和纤维组织减少。(3)心脏组织普鲁士蓝染色观察显示,与CIO组相比,L-SM组治疗后铁阳性染色面积减少了约38.64%(P<0.05),H-SM组则减少了约65.91%(P<0.01)。(4)组织切片马松三色染色表明,与CIO组相比,L-SM组与H-SM组的心脏组织纤维化面积与丹参给药呈剂量依赖性,随着给药剂量的增加分别缩小约30.08%和64.37%(P<0.01)。(5)经过丹参治疗后,L-SM组中Hyp含量降低至0.89±0.19μg/mg,H-SM组中Hyp含量降低至0.41±0.20μg/mg(与CIO组相比,P<0.01)。(6)与CIO组相比,丹参治疗可以明显增强SOD活性并降低MDA浓度(P<0.01)。(7)低剂量或高剂量丹参治疗后COL I蛋白阳性表达程度明显减弱,与CIO组相比,L-SM组与H-SM组分别减少了约48.35%或63.87%(P<0.01)。(8)与CIO组相比,TGF-β1蛋白表达水平在低剂量和高剂量丹参治疗后分别减低了约31.33%和73.02%(P<0.01),同时MMP-9表达水平分别减低了约25.11%和71.99%(P<0.01)。结论:丹参能有效的防治慢性铁超载性心肌纤维化,其作用机制与丹参抑制铁沉积、调节胶原蛋白的代谢和控制氧化应激反应有关。