论文部分内容阅读
阿尔茨海默病(Alzheimersdisease，AD)是一种神经系统退行性疾病，临床表现为进行性学习、记忆和认知功能障碍，智力减退乃至完全痴呆。AD的主要病理特征是脑内出现高密度的老年斑。研究发现，老年斑的主要成分是由39～43个氨基酸组成的β-淀粉样蛋白(Amyloidβ-protein，Aβ)。近年来，有关Aβ及其有效片段的神经毒性作用已有广泛报道。一些研究还表明，在AD出现神经变性前的早期记忆功能障碍中，可溶性Aβ已经发挥了重要作用。因此，关于AD临床前期记忆损害的发病过程及其可能机制，已经成为AD研究的焦点之一。长时程增强(long-termpotentiation，LTP)是一种由强直刺激作用于兴奋性突触传递通路所诱发的突触传递效率长时间增强的现象。转基因小鼠的实验表明，海马LTP的损伤与记忆行为的伤害密切相关。所以，海马LTP不仅被认为是突触可塑性的功能性指标之一，也是研究认知功能障碍疾病如AD的理想模型。
近年来，尽管包括本研究室在内的有关报道已经表明，Aβ及其活性片段可以抑制大鼠在体海马或离体海马脑片诱发的LTP，但Aβ压抑海马LTP的机制仍不清楚。特别是，迄今为止多数研究着重观察的是Aβ对短期型LTP(short-termLTP或early-phaseLTP，E-LTP)的影响，而对海马另一类型的LTP，即长持续LTP(long-lastingLTP或late-phaseLTP，L-LTP)的研究，则报道较少。E-LTP通常由一组高频刺激(highfrequencystimulus，HFS)引起，持续时间1h左右；L-LTP通常由连续给予的多组HFS引起，可持续3h以上。E-LTP和L-LTP的维持机制不同，前者与膜上已有受体蛋白的磷酸化有关，后者则包括了新的蛋白质的合成。Aβ及其片段是否也影响大鼠在体海马L-LTP的维持，尚无报道。如何除外Aβ可能因影响LTP的诱导而对其后LTP的维持所产生的干扰，也是研究Aβ影响L-LTP维持时需要解决的一个问题。
在本研究中，我们进行了如下工作：(1)采用多组HFS方案，有效地于在体海马诱导出了至少能维持3h以上的L-LTP，并且是在给予HFS后已经成功诱导出L-LTP的基础上立即进行Aβ片段的侧脑室注射，避免了Aβ片段对诱导的影响，从而观察了β-淀粉样蛋白31-35片段(Aβ31-35)对海马CA1区L-LTP的维持的影响；(2)基于以往蛋白激酶C(proteinkinaseC，PKC)在LTP诱导和维持机制中发挥重要作用的研究以及Aβ影响PKC活性的报道，本研究进一步观察了PKC在Aβ31-35引起的海马L-LTP抑制中所起的介导作用；(3)为了深入探讨Aβ片段抑制LTP是否与它们对突触后兴奋性和抑制性受体通道的调制有关，我们利用全细胞膜片钳技术观察了Aβ31-35对急性分离的海马CA1锥体细胞谷氨酸(Glu)、NMDA和γ-氨基丁酸(GABA)受体通道电流的影响；除此之外，本研究在多数实验中同时观察了Aβ25-35的作用，由于它被认为是Aβ分子的活性中心片段，通过两者的比较，试图证实31-35片段是全长Aβ分子发挥神经毒性作用的更短的活性中心。
第一部分：β-淀粉样蛋白31-35和25-35片段抑制大鼠在体海马L-LTP为了研究两个Aβ片段对海马CA1区L-LTP维持的影响及其机制，我们在多组HFS后1min经侧脑室注射Aβ31-35或Aβ25-35，连续观察并记录了刺激海马Schaffer侧枝诱发的CA1区兴奋性突触后场电位(fieldexcitorypost-synapticpotential，fEPSP)的变化。
第二部分：蛋白激酶C介导β-淀粉样蛋白31-35片段引起的L-LTP压抑鉴于PKC在海马LTP的维持中具有重要作用，加之已有报道表明，Aβ可以影响PKC活性，本研究在第一部分研究结果基础上，进一步通过侧脑室注射PKC激动剂phorbol12-myristate13-acetate(PMA)和拮抗剂chelerythrine，观察了Aβ片段引起的海马L-LTP的抑制是否需要PKC途径的介导。
第三部分：β-淀粉样蛋白31-35及25-35片段对海马CA1细胞兴奋性和抑制性受体通道电流的影响兴奋性和抑制性突触活动的适度调节是大脑发挥正常生理功能的前提，而兴奋性和抑制性受体/通道在突触传递过程、包括LTP的维持中起着关键性调制作用。因此，本研究利用全细胞电压钳技术进一步观察了Aβ25-35和Aβ31-35对急性分离的海马CA1区锥体神经元兴奋性和抑制性受体，包括Glu受体、NMDA受体和GABAA受体电流的影响。
总之，本研究利用场电位和膜片钳等电生理学手段，通过比较Aβ的两个不同片段对在体海马L-LTP和离体海马神经元突触后受体电流的影响，证实了Aβ31-35类似于Aβ25-35，能强烈抑制大鼠在体海马L-LTP的维持；PKC可能介导了Aβ31-35引起的海马L-LTP压抑；急性给予Aβ25-35和Aβ31-35对海马锥体细胞Glu受体和GABA受体电流分别具有抑制和易化作用。实验结果有助于进一步认识AD早期发生认知损害的神经机制，为解释AD时出现的学习记忆功能障碍提供了证据，为保护神经元免受Aβ伤害提供了线索。同时，实验结果也支持我们先前的假设：31-35片段可能是Aβ分子发挥神经毒性作用的活性中心。