背景:马钱子是中国药典收载的常用中药,具有非常好的研究价值和开发前景。本研究以马钱子中主要的有效成分和毒性成分士的宁和马钱子碱为研究对象,考察正常剂量和低、中、高毒性剂量下士的宁、马钱子碱及其代谢产物士的宁氮氧化物和马钱子碱氮氧化物在生物体内的代谢动力学情况,比较各成分以总碱或单体形式给药时体内动力学过程的差异,进一步研究毒性成分士的宁、马钱子碱及其氮氧化物的体内分布特征,为阐明马钱子碱和士的宁的体内毒性发生、发展规律及毒性作用机制提供可靠依据,对中药马钱子的临床合理使用及其毒性预警性发现具有重要意义。目的:1.建立液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS)法同时测定士的宁、马钱子碱、士的宁氮氧化物和马钱子碱氮氧化物在大鼠血浆中的浓度;2.采用已建立的LC-MS/MS法,考察正常剂量和低、中、高毒性剂量马钱子总碱给药后士的宁、马钱子碱、士的宁氮氧化物和马钱子碱氮氧化物在大鼠体内药物动力学的特征;3.采用已建立的LC-MS/MS法,比较正常剂量或高毒性剂量马钱子总生物碱与单体士的宁、单体马钱子碱给药后士的宁、马钱子碱、士的宁氮氧化物和马钱子碱氮氧化物在大鼠体内药动学特征;4.建立LC-MS/MS法同时测定士的宁、马钱子碱、士的宁氮氧化物和马钱子碱氮氧化物在大鼠组织匀浆中的浓度;5.采用已建立的LC-MS/MS法,研究正常剂量或高毒性剂量马钱子总碱给药后士的宁、马钱子碱、士的宁氮氧化物和马钱子碱氮氧化物的大鼠体内分布情况。方法:1.士的宁、马钱子碱、士的宁氮氧化物和马钱子碱氮氧化物在大鼠血浆中血药浓度测定方法的建立:以盐酸麻黄碱为内标,大鼠血浆样品采用甲醇沉淀法处理。色谱柱为 ZORBAX Eclipse XDB-C18柱(2.1×150mm,3.5 μm);流动相 A 为 10 mM 乙酸铵(用甲酸调pH=4),流动相B为甲醇,梯度为B相0～1 min,5%;1～6.5 min,5%～70%;6.5～7.5 1min,70%;7.5～7.6 min,70%～5%;7.6～11min,5%;流速0.2mL·min-1;柱温30℃;进样量5μL。用电喷雾离子化和正离子多离子反应监测(MRM)方式检测士的宁、马钱子碱、士的宁氮氧化物和马钱子碱氮氧化物;离子源为电喷雾ESI源;喷雾电压IS为5500 V;雾化温度为350℃;帘气CUR为40;碰撞气CAD为12;雾化气GAS1为20。2.不同剂量马钱子总碱给药后士的宁、马钱子碱、士的宁氮氧化物和马钱子碱氮氧化物的体内药物动力学研究:SD雄性大鼠随机分为4组,分别单次灌胃正常剂量和低、中、高毒性剂量马钱子总碱溶液,定时采血,分离血浆,采用已建立的LC-MS/MS法测定血浆中士的宁、马钱子碱、士的宁氮氧化物和马钱子碱氮氧化物的浓度,计算药物动力学参数,并对所得的主要药动学参数进行统计分析。3.正常剂量和高毒性剂量马钱子总碱、士的宁和马钱子碱单体给药后士的宁、马钱子碱、士的宁氮氧化物和马钱子碱氮氧化物的体内药物动力学研究:SD雄性大鼠随机分为6组,分别单次灌胃正常剂量或高毒性剂量马钱子总碱、单体士的宁和单体马钱子碱,定时采血,分离血浆,采用已建立的LC-MS/MS法测定血浆中士的宁、马钱子碱、士的宁氮氧化物和马钱子碱氮氧化物的浓度,计算药物动力学参数,并对所得的主要药动学参数进行统计分析。4.士的宁、马钱子碱、士的宁氮氧化物和马钱子碱氮氧化物在大鼠组织匀浆中药物浓度测定方法的建立:以盐酸麻黄碱为内标,大鼠组织匀浆样品采用氯仿液液萃取法处理。色谱柱为ZOR(2.Ec1ipseXDB-C18柱150mm,3.5 μm);流动相A为10 mM乙酸铵(用甲酸调pH=4),流动相B为甲醇,梯度为B相0～1min,5%;1～6.5 min,5%～70%;6.5～7.5 min,70%;7.5～7.6 min,70%～5%;7.6～11 min,5%,流速 0.2 mL · min-1,柱温30℃,进样量5 μ L。用电喷雾离子化和正离子多离子反应监测(MRM)方式检测士的宁、马钱子碱、士的宁氮氧化物和马钱子碱氮氧化物;离子源为电喷雾ESI源;喷雾电压IS为5500 V;雾化温度为350℃;帘气CUR为40;碰撞气CAD为12;雾化气GAS1为20。5.正常剂量和高毒性剂量马钱子总碱给药后士的宁、马钱子碱、士的宁氮氧化物和马钱子碱氮氧化物的体内分布研究:SD雄性大鼠随机分为2组,分别单次灌胃正常剂量和高毒性剂量马钱子总碱溶液,定时处死,取血、心、肝、脾、肺、肾和脑,匀浆,采用已建立的LC-MS/MS法测定生物样品中士的宁、马钱子碱、士的宁氮氧化物和马钱子碱氮氧化物的浓度。结果:1.士的宁、马钱子碱、士的宁氮氧化物和马钱子碱氮氧化物在大鼠血浆中血药浓度测定方法的建立:士的宁和马钱子碱的线性范围为0.510～306.3ng·mL-1,士的宁氮氧化物和马钱子碱氮氧化物的线性范围为0.102～306.3 ng · mL-1;四种成分的相对回收率为(89.44±3.43)%～(113.01±5.01)%;提取回收率为(73.60±9.70)%～(90.50±1.64)%;基质效应为(83.30±4.41)%～(107.00± 6.05)%;日内、日间精密度RSD≤14.88%;血样稳定性准确度均在(88.92±2.92)%～(116.90±3.30)%。2.不同剂量马钱子总碱给药后士的宁、马钱子碱、士的宁氮氧化物和马钱子碱氮氧化物的体内药物动力学研究:马钱子总碱溶液1.2、1.8、2.4、3.0 mg ·kg-1给药后,士的宁和马钱子碱Cmax和AUC随着剂量的增加而增加,与剂量的增加呈比例,药动学参数结果表明士的宁和马钱子碱分别在0.4～1mg·kg-1和0.2554～0.6385 mg·kg-1剂量范围内表现出线性动力学特征;采用SPSS 19.0软件对所得的主要药动学参数进行分析,其中,Cmax和AUC经剂量校正后进行方差分析(ANOVA),结果表明,正常剂量和低、中、高毒性剂量组士的宁和马钱子碱的主要动力学参数Cmax、AUC和t1/2之间不具有显著性差异。3.正常剂量和高毒性剂量马钱子总碱、士的宁和马钱子碱单体给药后士的宁、马钱子碱、士的宁氮氧化物和马钱子碱氮氧化物的体内药物动力学研究:正常和毒性剂量马钱子总碱组的士的宁和马钱子碱Cmax和AUC均较正常和毒性剂量单体士的宁溶液、单体马钱子碱溶液的低;SPSS 19.0软件统计分析结果表明,正常剂量和毒性剂量下总碱组和单体组士的宁和马钱子碱的主要动力学参数AUC、Cmax和t1/2之间不具有显著性差异。4.士的宁、马钱子碱、士的宁氮氧化物和马钱子碱氮氧化物在大鼠组织匀浆液中药物浓度测定方法的建立:士的宁和马钱子碱的线性范围为1.02～405 ng·mL-1,士的宁氮氧化物和马钱子碱氮氧化物的线性范围为0.306～135ng·mL-1;士的宁、马钱子碱、士的宁氮氧化物和马钱子碱氮氧化物的相对回收率为(85.94±1.43)%～(113.77±5.19)%;提取回 收率为(79.20±8.54)%～(110.00±6.48)%;基质效应为(94.20±4.84)%～(110.00±10.29)%;日内、日间精密度RSD≤14.9%;组织匀浆样稳定性准确度均在(89.13±2.19)%～(110.81 土3.86)%。5.正常剂量和高毒性剂量马钱子总碱给药后士的宁、马钱子碱、士的宁氮氧化物和马钱子碱氮氧化物的体内分布研究:大鼠单次灌胃正常剂量和高毒性剂量马钱子总碱溶液后,士的宁、马钱子碱、士的宁氮氧化物和马钱子碱氮氧化物在组织中均有不同程度的分布,正常剂量组士的宁在各组织中含量由大到小依次为:肾>脾>肝>肺>心>脑>血,毒性剂量组的顺序依次为:肾>肝>肺>脾>心>脑>血;正常剂量组马钱子碱在各组织中含量由大到小依次为:肾>肝>脾>肺>心>血>脑,毒性剂量组的顺序依次为:肝>肾>脾>肺>心>血>脑;正常剂量组士的宁氮氧化物在各组织中含量由大到小依次为:脾>肝>肾>肺,毒性剂量组的顺序依次为:脾>肝>肾>肺。马钱子碱氮氧化物仅在毒性剂量给药后的肝脏中被检测到。结论:本文建立的液相色谱-质谱(LC-MS/MS)法灵敏、准确、简便、快速,可用于同时测定生物样品(血浆和组织匀浆)中士的宁、马钱子碱、士的宁氮氧化物和马钱子碱氮氧化物的浓度,实验结果表明,士的宁和马钱子碱在大鼠体内吸收快,在研究剂量范围0.4～1 mg · kg-1和0.2554～0.6385 mg · kg-1内均表现出线性动力学特征;总碱和单体的对比研究结果发现,马钱子总生物碱中的其他生物碱成分对士的宁和马钱子碱的体内吸收具有一定的抑制作用,推测马钱子总碱中多成分的相互作用可能在影响士的宁和马钱子碱体内吸收方面上降低了这两者的体内毒性作用;另外,士的宁、马钱子碱、士的宁氮氧化物和马钱子碱氮氧化物在大鼠组织中均有不同程度的分布,以肾脏、肝脏的分布最多,脑中分布最少,说明士的宁和马钱子碱均可穿透血脑屏障到达脑,从而对中枢产生作用。