【摘 要】
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背景:骨缺损修复是临床常见难题之一,需要探索有效的方法来加速骨愈合及骨再生。骨髓间充质干细胞(Bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)是骨再生研究中主要的种子细胞来源。BMSCs的成骨分化受到多种因子的影响。其中,骨形态发生蛋白(Bone morphogenetic proteins,BMPs)能够诱导BMSCs的成骨或成软骨分化,血管内皮
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背景:骨缺损修复是临床常见难题之一,需要探索有效的方法来加速骨愈合及骨再生。骨髓间充质干细胞(Bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)是骨再生研究中主要的种子细胞来源。BMSCs的成骨分化受到多种因子的影响。其中,骨形态发生蛋白(Bone morphogenetic proteins,BMPs)能够诱导BMSCs的成骨或成软骨分化,血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)是细胞外基质重塑,血管生成和骨形成的重要协调者,这两者的联合应用有利于优化成骨的实现。目前,通过基因治疗的手段将目的基因转移至细胞内进行骨再生研究的方法已得到了广泛的应用。目的:体外培养骨髓间充质干细胞BMSCs,分析BMP-2和VEGFA基因分别转染BMSCs后的细胞学行为;探索最佳的BMP-2和VEGFA基因修饰细胞比例,通过调控表达合适的两种生长因子水平,以达到最佳的促进微血管和新骨形成的效应。方法:采用贴壁法体外分离、培养和纯化BMSCs;用腺病毒载体构建BMP-2和VEGFA基因修饰的BMSCs细胞系,通过荧光监测判断转染效率,分别在第3、7、14、21天通过RT-qPCR、ELISA验证两种目的基因的表达,CCK8检测转染后细胞增殖能力;将两种基因修饰的细胞按如下比例混合培养并分组:BMP-2:VEGFA=1:3,1:1,3:1,单纯BMP-2组,单纯VEGFA组,空白对照组;分别在第14、21天通过RT-qPCR、ELISA检测成骨相关因子Runx2、OCN的表达情况;在第21天通过碱性磷酸酶定性定量检测、茜素红染色分析比较各组的成骨效应。结果:成功分离并体外培养BMSCs;当MOI=50时,Ad-BMP-2和Ad-VEGFA腺病毒转染效率达95%以上,RT-qPCR及ELISA结果证实了两种基因的成功表达,且随着培养时间的延长,目的基因的表达呈下降趋势;转染后细胞增殖能力与空白对照组相比无明显影响(p>0.05);成骨相关因子Runx2和OCN的表达检测、茜素红染色分析及碱性磷酸酶ALP定性定量分析结果均显示:单纯VEGFA组及低比例BMP-2:VEGFA(1:3)组与空白对照组无明显差异(p>0.05),高比例BMP-2:VEGFA(3:1)组则明显高于单纯BMP2组及其他各组(p<0.05),表明过量的VEGFA对促成骨分化并无益处,而高比例组的成骨效应最佳。结论:腺病毒载体介导的基因治疗能实现对BMSCs的高效转染,且对细胞增殖能力无明显影响;过量的VEGFA对BMSCs的成骨分化可能有抑制作用;高比例BMP-2:VEGFA修饰的BMSCs成骨效应最佳,是优化骨再生修复的良好选择。
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