前言胃癌是源自胃粘膜上皮的恶性肿瘤,在我国发病率很高,死亡率占恶性肿瘤的第一位。胃癌是多种基因变化参与和积累的结果,揭示这些基因变化的规律,不仅可以阐明癌变的机制,更可以协助肿瘤的诊断、治疗和预后判断。肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)主要由间质细胞如成纤维细胞、巨噬细胞等产生,是一种上皮形态发生过程中的旁分泌调节物,具有多种生物学特性,能刺激多种上皮和内皮细胞进行有丝分裂、运动以及促进肾小管形态发生和血管内皮再生。HGF生物学活性由原癌基因c-met编码的跨膜受体蛋白所介导。研究发现HGF/c-Met通路异常活化在肿瘤生长、侵袭和转移中起重要作用。在许多上皮源性肿瘤中常可测得HGF过度表达,乳腺癌患者组织和血液中HGF表达水平显著高于非乳腺癌患者,出现淋巴结或肝转移者表达水平最高,而且HGF和c-Met表达水平与肿瘤的复发有关。对HGF异常表达的人类乳腺癌细胞系的HGF启动子区1kb范围内序列突变筛查研究发现,HGF的异位表达和可诱导表达的分子基础是HGF基因转录起始点上游一个cis作用元件DNA序列的改变。野生型cis作用元件是30个脱氧腺苷酸(A)形成的PolyA结构,将这个PolyA结构命名为DATE (deoxyadenosine tract element, DATE),当DATE发生截短改变,就会改变某些转录因子如C/EBP-β1、PAPP1和PAPP2对HGF启动子区DATE及临近结合位点的结合力,增加HGF启动子的活性,促进其在肿瘤细胞中表达。研究发现复发性胃癌患者血清HGF显著高于正常人和原发性胃癌者,且HGF水平与肿瘤浸润深度及血管受侵程度密切相关,在胃癌中,胃纤维母细胞通过激活HGF/c-Met系统来刺激肿瘤的生长和浸润。胃癌中常可见到c-Met的扩增和过度表达,因此,HGF/c-Met与胃癌的发生、发展、转移及预后密切相关。为探讨HGF的DATE截短改变是否与胃癌发生相关,我们检测了胃癌细胞系和80例胃癌患者HGF启动子区DATE截短改变情况,并进一步用RT-PCR检测HGF的DATE发生截短改变后,HGF在相应胃癌细胞系和胃癌组织中的表达,明确二者的相关性,为胃癌的诊断和治疗开辟一个新思路。材料与方法1、胃癌细胞系、胃癌组织和正常人外周血HGF的DATE截短筛查常规酚氯仿法提取胃癌细胞系、80例胃癌组织及相应癌旁组织和100例正常人外周血基因组DNA,通过PCR反应扩增HGF启动子区DATE序列,产物经8%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,检测到DATE截短改变的标本进行TA克隆测序验证,HeLa细胞系DATE的PolyA数目是30,与正常人基因组DATE序列相同,将HeLa细胞DATE作为野生型,与野生型DATE相比,胃癌细胞系、胃癌组织和正常人DATE的PolyA缺失大于等于5A,定义为DATE出现截短改变。2、RT-PCR检测胃癌细胞系和胃癌组织中HGF表达5种胃癌细胞系和30例胃癌组织和相应癌旁组织用TRIzol法提取总RNA后,反转录合成cDNA, RT-PCR检测HGF表达,明确DATE截短改变与HGF表达的关系。3、DATE截短改变和微卫星不稳定性的相关性分析选取微卫星位点D5S396和D5S2056, PCR扩增发生DATE截短改变的6例胃癌组织和相应癌旁组织的2个微卫星位点,比较胃癌组织DATE截短改变和微卫星不稳定现象之间的相关性。实验结果1、胃癌细胞系HGF启动子区DATE截短改变和HGF表达关系本研究发现胃癌细胞系MGC803、MKN28和HGC27发生了DATE截短改变,基因型分别是30A/25A、25A/25A和27A/25A。胃粘膜上皮细胞系GES-1和胃癌细胞系SGC7901、BGC823和AGS DATE没有截短改变。RT-PCR检测HGF在胃粘膜上皮细胞系GES-1及胃癌细胞系SGC7901、MGC803、BGC823和AGS中表达,发现HGF只在DATE出现截短改变的MGC803中表达,DATE没有截短改变的细胞系中没有表达,这表明HGF启动子区DATE的截短改变促进了HGF在胃癌细胞系的表达。2、胃癌组织中HGF启动子区DATE截短改变和HGF表达关系本研究检测了80例胃癌组织及相应癌旁组织中HGF启动子区DATE的截短改变情况。发现15%(12／80)的胃癌患者存在DATE的截短改变。胃癌组织DATE的PolyA的截短变化范围从5A-20A。在12例DATE截短改变的胃癌样本中,7例(58%)DATE截短改变只发生在胃癌组织,而相应癌旁组织DATE没有截短改变,其余5例DATE截短改变同时存在于癌组织和癌旁组织,提示DATE的截短改变与胃癌发生密切相关。RT-PCR检测HGF在30例胃癌组织中表达情况,发现只在DATE截短改变的6例(占20%)胃癌组织中有HGF表达,而未出现截短改变的胃癌组织和癌旁组织未见HGF表达。且DATE截短最多的标本(其癌组织DATE基因型20A/10A), HGF表达最高,以上结果提示HGF表达水平与DATE截短程度相关。3、HGF启动子区DATE截短改变与胃癌发生相关性分析研究中发现DATE在相应癌旁组织中也出现截短改变,提示DATE的截短改变具有多态性。分析了100例中国正常人群外周血中HGF启动子区DATE截短改变情况,发现4%(4／100)的人群中出现DATE截短改变。比较胃癌患者和正常人群中DATE截短发生率,χ2检验显示两者差别有统计学意义(P<0.05),表明DATE截短与胃癌发生相关。4、DATE截短改变和微卫星不稳定性相关性分析为了确定DATE在肿瘤组织中的不稳定现象和肿瘤组织中微卫星不稳定性之间的相关性,PCR扩增已确定DATE截短改变的6例胃癌组织和癌旁组织的D5S396和D5S2056微卫星位点,发现5例在D5S396和D5S2056两个位点都出现了微卫星不稳定性,一例未检测到微卫星不稳定性,这例标本癌旁组织和癌组织DATE出现相同程度的截短改变。这表明通过分析胃癌组织DATE截短改变可以判定胃癌组织发生了微卫星不稳定性改变,以上提示HGF启动子区DATE可作为筛查胃癌组织微卫星不稳定性的一个简单而有效的指标。结论(1)胃癌中存在HGF启动子区DATE的截短改变,DATE的截短改变能促进HGF在胃癌中的表达,表明DATE的截短改变与胃癌发生密切相关。(2)胃癌中DATE的截短改变,能有效判定胃癌组织发生微卫星不稳定现象,可作为筛查胃癌组织微卫星不稳定性的一个简单而有效的指标。