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背景和意义肝细胞肝癌(HCC)是原发性肝脏肿瘤的主要类型。其全球发病率正以惊人的速度增长,由于其病因多样、预后差等特点使得对人类健康的威胁日益突出。HCC的死亡率居恶性肿瘤的第三位,发病率居于常见恶性肿瘤的第五位,全球每年有超过60万病例。HCC在发展中国家发病率较高,80%的病例发生在亚洲和撒哈拉以南非洲地区。从这些数据可以看出,发展一种更有效的治疗HCC的方法已经变得十分重要。目前的治疗方案,如手术切除、肝移植,经皮消融等,然而治疗有效率较低,需要继续寻找新的更有效肝癌治疗药物。目前所用的有限的化疗药物,其抑制HCC的分子机制还不十分清楚。许多研究致力于开发小分子抑制剂,抑制肝癌细胞在体外及体内的生长,引起细胞周期阻滞或／和诱导癌细胞死亡。核心蛋白聚糖(Decorin),是一种小的富含亮氨酸的蛋白多糖家族中的一员,己被证明通过上调p21蛋白抑制肝癌细胞的生长。p21蛋白是一种通过p53独立通路调控的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂。Decorin抑制肝癌细胞的生长的完整机制目前仍没有解释清楚,因此,相关的研究,特别是对Decorin上调细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂的能力的研究将成为最受关注的问题。许多研究已经证实了Decorin对于几种类型的肿瘤的抑制作用,然而,只有少数的研究证实Decorin对于HCC的抑制作用,并且Decorin对于肿瘤细胞生长的抑制作用的分子机制还没有被完全解释清楚。目的：本研究着重阐述decorin抗肿瘤效果是否通过p53途径起作用。首先构建重组人Decorin基因的真核表达载体pcDNA3.1-decorin;然后研究pcDNA3.1-decorin对于p53野生型HepG2和p53缺失型Hep3B肝癌细胞系的影响；以及探讨pcDNA3.1-decorin对p57基因的激活作用,最终揭示decorin基因转染对HCC细胞的拮抗作用及其分子机制。方法：应用基因重组技术构建了真核表达载体pcDNA3.1-decorin。选取两种肝癌细胞系：p53野生型HepG2;和p53缺失型Hep3B,然后将pcDNA3.1-decorin转染到两种细胞系中。每个细胞系又各分成三组：重组Decorin组(pcDNA3.1-DCN)、空载体组(pcDNA3.1)和对照组(未经转染的HepG2或Hep3B细胞)。转染后在不同时间点收集细胞分别进行如下实验：采用MTT法进行细胞增殖试验；应流式细胞仪进行细胞周期和凋亡的分析；利用实时定量PCR进行caspase-3、bcl-2和p57的表达检测。实验结果应用spssl3.0软件进行统计分析,p<0.05定义为具有统计学意义。结果：1.成功构建了pcDNA3.1-DCN真核表达载体：重组质粒pcDNA3.1-DCN克隆后,经1%琼脂糖凝胶电泳和测序分析,电泳及测序结果均表明己成功构建了pcDNA3.1-DCN真核表达载体。2.重组pcDNA3.1-DCN基因转染对p53野生型HepG2和p53缺失型Hep3B肝癌细胞系均发生了明显的抑制作用：MTT结果表明,瞬时转染pcDNA3.1-DCN到HepG2和Hep3B细胞72小时后,pcDNA3.1-DCN组OD值明显低于对照组和pcDNA3.1组细胞,在统计学上有显著差异(p<0.05)3.重组pcDNA3.1-DCN基因转染可使p53野生型HepG2和p53缺失型Hep3B两组肝癌细胞株生长阻滞在G0/G1期：在肝癌HepG2细胞中,pcDNA3.1-DCN组、pcDNA3.1组和对照组G0/G1期的细胞所占比例分别为66.126±2.701%、57.116±1.421%以及55.323±1.641%；在Hep3B细胞系中,相应的G0/G1期的细胞所占比例分别为63.800±2.813%、53.573±2.526%以及52.960±2.461%,在统计学上有显著差异(p<0.05)4.重组pcDNA3.1-DCN基因转染可使p53野生型HepG2和p53缺失型Hep3B两组肝癌细胞株发生凋亡：在肝癌HepG2细胞中,对照组、pcDNA3.1组以及pcDNA3.1-DCN组HepG2细胞凋亡细胞百分比分别为3.1±0.3%、2.8±0.2%以及10.2±0.6%；在Hep3B细胞系中,相应的细胞凋亡百分比分别为1.667±0.321%,3.900±0.458%和6.467±0.351%,在统计学上有显著差异(p<0.05)5.重组pcDNA3.1-DCN基因转染可使p53野生型HepG2和p53缺失型Hep3B两组肝癌细胞株bcl-2mRNA显著降低和caspas-3mRNA显著升高：应用RT-PCR方法,结果显示,与对照组和载体组相比,pcDNA3.1-DCN组细胞bcl-2mRNA表达显著降低,caspase-3mRNA表达显著升高,在统计学上有显著差异(p<0.05)6.重组pcDNA3.1-DCN基因转染可使p53野生型HepG2和p53缺失型Hep3B两组肝癌细胞株p57KIP2mRNA显著升高：应用RT-PCR方法,结果显示,与对照组和载体组相比,pcDNA3.1-DCN组细胞p57KIP2mRNA表达显著升高,在统计学上有显著差异(p<0.05)。结论：本论文重点阐述了重组人Decorin基因转染对于HepG2和Hep3B肝癌细胞的抑制作用及其分子机制的研究。1.本项目构建了重组真核表达载体pcDNA3.1-DCN,并将其转染到p53野生型HepG2和p53缺失型Hep3B两组肝癌细胞株中,结果显示,Decorin对两种细胞均有明显的抑制作用,表明decorin抑制肝癌细胞可能不是通过p53途径。2.重组真核表达载体pcDNA3.1-DCN转染两种肝癌细胞是通过下调bcl一2和上调caspase-3mRNA的表达以及使细胞停滞在G0/G1期,从而抑制两种肝癌细胞的增殖并导致细胞凋亡3.重组真核表达载体pcDNA3.1-DCN转染提高了HepG2和Hep3B细胞p57KIP2mRNA表达水平,提示decorin抑制肝癌细胞可能与p57KIP2有关。本文最新发现了重组人Decorin基因转染具有激活HepG2和Hep3B肝癌细胞的p57KIP2mRNA表达水平,抑制两种肝癌细胞的生长,这可能对于发现decorin抑制肝癌细胞的潜在分子靶点具有重要作用。此外,decorin抗肿瘤的作用及其分子机制有待于深入研究。