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背景证候是中医临床诊疗的基础和靶标,普遍认为,客观存在的证候具有与之对应的生物学基础,探索证候生物学基础有利于阐明中医的科学本质。几十年来,学者从整体、细胞、分子等多个层面,生理、生化、超微结构等多个方面对证候生物学基础做了相关探索,其中陈可冀院士和沈自尹院士分别在血瘀证和肾阳虚证研究上取得重大进展。随着现代组学技术的快速发展,证候生物学基础研究已进入基因、转录、蛋白组学层面。以探究“生物标志物群”为目的的证候生物学基础研究成为目前主要研究方向。生物标志物被广泛应用于现代医学中的疾病预防、诊断、个性化治疗和预后判断等诸多方面。在证候研究领域中,主要用于证候诊断,证候分型以及药物作用靶点研究。证候的形成演变本质上是基因与环境相互作用的结果,但在基因表达成蛋白质并发挥生物学效应的过程中,受到多环节、多因素调控,解析基因表达的调控对于理解证候的发生、转化具有重要的作用,其中RNA层面是基因调控的关键环节,也是目前生物标志物研究的热点。气滞血瘀证是中医临床常见证候之一,据研究显示,涉及心血管疾病、消化系统疾病、妇科疾病等至少76种疾病。现有研究已发现其与微循环障碍、血液流变学改变、炎症、凝血-纤溶系统失衡、内皮功能障碍、血脂异常、免疫功能紊乱等病理改变相关,另外,气滞血瘀证研究在组学层面也有一定进展,但仍未完全阐明气滞血瘀证发生的机制,尚缺少可用于气滞血瘀证临床诊断的生物标志物。目的运用生物信息学方法分析气滞血瘀证RNA差异表达谱,筛查可能成为气滞血瘀证诊断生物标志物的目标RNA,并通过实时荧光定量聚合酶链式反应技术（quantitative real time polymerase chain reaction,qRT-PCR）与诊断效能分析,探索潜在的气滞血瘀证诊断生物标志物,为气滞血瘀证客观化诊断指标研究提供实验基础,也为证候诊断生物标志物研究提供思路与方法。方法:1.基于文献的气滞血瘀证RNA差异表达谱生物信息学分析检索中国知网和PubMed数据库中气滞血瘀证组学层面研究的相关文献,提取并总结RNA差异表达结果,应用GeneCards（?）:The Human Gene Database数据库进行基因功能注释,借助DAVID平台对差异表达RNA进行功能富集与信号通路分析,利用starBase v2.0 平台中的 miRNA-target interactions 模块、miRNA-lncRNA interactions 模块、miRNA-circRNA interactions 模块与 STRING Version 10.5 平台中的 Multiple proteins 模块建立气滞血瘀证ceRNA-mRNA-protein相互作用网络,并筛选可能成为气滞血瘀证诊断生物标志物的目标RNA,结合团队前期研究发现的气滞血瘀证差异表达RNA,共同进行下一步实验验证。2.气滞血瘀证RNA层面潜在的诊断生物标志物研究临床纳入气滞血瘀证患者24例,共5组,其中高血压气滞血瘀证患者5例,冠心病气滞血瘀证患者5例,慢性胃炎气滞血瘀证患者5例,脑梗死缓解期气滞血瘀证患者5例,健康人4例,并完成一般资料与血液标本采集;从血液标本中分离并纯化白细胞,Trizol法提取总RNA,利用分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测RNA浓度和完整性;将RNA逆转录为cDNA,运用Roche LCPDS2分别设计不同RNA的特异性引物,进行qRT-PCR反应,并计算差异表达量;通过独立样本t检验和单因素方差分析方法检验目标RNA组间差异表达的统计学意义;绘制目标RNA ROC曲线并计算曲线下面积与约登指数,分析目标RNA的诊断效能,敏感度和特异度。结果:1.基于文献的气滞血瘀证RNA差异表达谱生物信息学分析①文献分析显示,共有41篇文献报道了气滞血瘀证组学层面研究的结果,其中蛋白表达研究数量最多,其次为mRNA、SNP、miRNA、DNA甲基化、lncRNA、circRNA。②差异表达谱GO功能富集显示,在生物过程方面,气滞血瘀证相关基因主要与细胞对环状化合物的反应、对转录、神经元凋亡基因表达的负性调控以及炎症反应相关;在细胞组成方面,气滞血瘀证相关基因主要与蛋白复合物、核质、细胞表面相关;在分子功能方面,气滞血瘀证相关基因主要与可识别蛋白结合、酶结合、转录调控区域的基因结合相关,其中炎症反应与目前气滞血瘀证生物学基础研究联系最为密切。③差异表达谱KEGG信号通路分析显示,与气滞血瘀证相关基因可能有关的信号通路包括肿瘤相关蛋白多糖、肿瘤坏死因子信号通路、肿瘤相关信号通路、人类T淋巴细胞病毒感染,其中肿瘤坏死因子信号通路与目前气滞血瘀证生物学基础研究联系较为密切。④综合多种生物信息学分析结果,确定 TGF-betal、HSP70、CD62p、DES、HLA-DQA1、UCHL5、circRNA09849、circRNA11523、circRNA18046、circRNA24450 作为下一步验证的目标RNA。2.气滞血癖证RNA层面潜在的诊断生物标志物研究①目标RNA表达量两组间比较,circRNA09849和UCHL5表达量在气滞血瘀证组与健康对照组间有显著差异,p<0.05,其余目标RNA表达量两组间比较无显著差异,p>0.05。②目标RNA表达量多组间比较,UCHL5表达量在不同组间存在显著差异,p=0.010,其余目标RNA表达量各组间比较无显著差异,但存在高于或低于健康对照组的趋势;组间两两比较,UCHL5各疾病气滞血瘀证组与健康对照组比较表达量均存在差异,各疾病组间比较均无差异,侧面反映了 UCHL5的非疾病特异性。③UCHL5在气滞血瘀证患者中表达量下降1.53倍,具有生物学意义。④UCHL5的诊断效能分析结果显示,该指标ROC曲线下面积为0.900,p=0.01322,提示该指标诊断准确性高,最大约登指数为0.75,相应的敏感度为0.75,特异度为1,提示敏感度、特异度较高。结论:气滞血瘀证相关RNA涉及多功能、多通路,其中与炎症反应与肿瘤坏死因子信号通路联系最为紧密;UCHL5是潜在的气滞血瘀证RNA层面诊断生物标志物,具有较高的诊断准确性、敏感度以及特异度。