分子是保持物质化学性质的最小单元,从单分子的水平上活体、原位、实时地研究物质之间的相互作用是人类在探索生命奥秘的过程中一直孜孜以求的梦想。近年来,不断发展的单分子光学技术正在促使这一梦想转变为现实,荧光相关光谱(Fluorescence Correlation Spectroscopy,FCS)正是这类技术的一个典型代表。荧光相关光谱通过显微共焦技术构建一个极小的检测微区(通常小于10-15 L),荧光分子或粒子由于布朗运动或化学反应等动力学过程而不断进出该微区,引起微区内荧光信号的涨落即荧光强度随着时间而变化。高灵敏度的检测器以极高的时间分辨率捕获不断涨落的信号,这些信号经过自相关或互相关分析,就能解析出单分子或单粒子的动力学信息。作为单分子光学技术的先驱,荧光相关光谱自上个世纪七十年代诞生以来,凭借其极高的灵敏度和时间分辨率以及良好的统计可靠性,目前已成为研究单个荧光分子动力学行为的常规方法,在大分子构象、信号识别、生化反应动力学等生物医学领域得到了广泛的应用。但是,荧光相关光谱也面临着自身的限制和新的挑战。一是传统的荧光探针,包括有机荧光染料、荧光蛋白、量子点等,在强光或长时间照射下均存在荧光衰减甚至漂白的现象,此外,量子点还存在荧光闪烁。探针自身荧光强度的变化与动力学过程引起的强度变化叠加在一起,严重干扰检测的准确性。荧光强度不断衰减的探针也无法满足生物体系内的长时间实时监测的要求。二是生物、医学等领域的迅速发展给分析科学带来了新的挑战,复杂、不均匀的生物体系要求高通量、多通道的并行检测手段。目前的荧光相关光谱技术采用共聚焦光学构型,光电倍增管或雪崩二极管(Avalanche Diode,APD)是最常用的检测器,所以只能进行单窗口检测,无法针对不均匀体系实现高通量、多通道的并行检测。本论文从以上两个科学问题出发,选择金属纳米粒子替代传统的荧光分子作为光学探针,创造性地引入全内反射(Total Internal Reflection,TIR)、暗场(Dark field)等光学构型,使用高灵敏度的电子倍增电荷耦合器件(Electron Multiplying Charge-Coupled Device,EMCCD)作为检测器,建立新型波动相关光谱方法,将波动相关光谱扩展至更广的领域,解决以上两个问题。主要研究工作包括以下几个方面:(1)建立基于全内反射构型的时空分辨散射相关光谱(Spatially Resolved Scattering Correlation Spectroscopy,SRSCS)。首先,我们合成了化学性质稳定、尺寸均匀的银纳米粒子,采用其强烈的散射光作为检测信号。在全内反射荧光显微镜平台上,通过使用自制的毫米级小孔替换原系统的发射滤光片,将银纳米粒子的散射光与激发光及其反射光进行有效分离,同时采用电子倍增电荷耦合器件作为检测器实现阵列检测。利用这种新型的波动相关光谱方法,我们对粒径为16±2 nm的银纳米粒子进行了动力学行为研究,新方法对纳米粒子浓度和扩散系数的变化均有灵敏的响应,线性相关系数分别为0.998和0.988,检测信噪比高达14.4。实验表明,这种新方法能高灵敏、高通量、多通道地检测纳米粒子的浓度、扩散速度等动力学信息。此外,我们还研究了不同实验条件对检测结果的影响,证明采样200000次的检测结果具有可靠的统计精度。(2)建立基于暗场激发构型的时空分辨散射相关光谱(Tempo-Spatially Resolved Scattering Correlation Spectroscopy under Dark-Field Illumination,DFSCS)。暗场显微镜是一种简单易用、价格低廉的光学显微镜,只需在常用的明场显微镜上装配一个暗场聚光镜即可实现。我们首次在暗场显微构型上建立了波动相关光谱检测方法。作为波动相关光谱家族中一种全新的光学构型,我们首先推导了DFSCS的理论模型,并提出了评价该系统统计精度的方法。然后我们通过计算机模拟和实验结果验证了模型的适应性和可靠性。蒙特卡洛模拟(Monte Carlo simulation)得到的粒子浓度和扩散系数与设定值的差别小于4%。我们还从理论和实验两个角度分别研究了新系统的灵敏度,证实DFSCS能准确检测纳米粒子浓度和扩散系数的变化,线性相关系数分别为0.972和0.993,检测信噪比高达17.6。针对金纳米粒子的实际检测结果表明该系统对纳米粒子的浓度、扩散系数等动力学参数有灵敏的响应。DFSCS的时间分辨率提高到0.5 ms每帧,单次检测的采样次数达到500000次,统计精度更高。(3)将时空分辨散射相关光谱应用于研究细胞内纳米粒子的动力学行为。我们利用癌症治疗药物赫赛汀(Herceptin)对直径16 nm的金纳米粒子进行修饰,通过赫赛汀的介导作用将金纳米粒子转运至人子宫颈癌Si Ha细胞内。这些纳米粒子特征性的分布在细胞膜或不同的细胞器中。在暗场显微镜下,细胞内的金纳米粒子散发出强烈的散射信号。我们利用时空分辨散射相关光谱系统收集这些信号,研究纳米粒子在细胞内不同区域的动力学行为和细胞内环境的不均匀性。纳米粒子的扩散系数分布在0.0562μm s至0.235μm2 s之间,说明微区内粒子的扩散速度各不相同。实验结果表明,时空分辨散射相关光谱的不同通道可以同时检测细胞内多个区域,纳米粒子动力学行为的差异表明细胞内环境是一个极其不均匀的体系。我们结合扩散定律,证实细胞内存在分隔的微区。