目的：　　1.建立基于 PCR技术结合液相色谱串联质谱(PCR-LC-MS/MS)的基因片段区域甲基化分析方法。　　2.运用建立的分析方法检测结直肠癌组织及癌旁组织ALX4、CNRIP1、HIC1、BCL2和FBN1以及结直肠癌患者血浆及正常人血浆中ALX4、CNRIP1、HIC1、BCL2和FBN1的甲基化水平，探讨多个基因甲基化变化与结直肠癌发生发展的关系，为肿瘤DNA甲基化标志物的应用提供科学依据。　　方法：　　1.样品收集和DNA提取纯化　　培养结肠癌HCT116细胞和人小肠上皮细胞FHs74Int，收集广东医科大学附属医院胃肠外科30例手术切除且病理确诊为结直肠癌的患者术中的癌组织及癌旁组织，10例结直肠患者血浆及10例健康对照者血浆标本，置-80℃保存。采用不同的试剂盒提取DNA，利用琼脂糖凝胶电泳检测完整性，NanoDrop2000超微量分光光度计测得浓度及纯度，得出最优的提取方法。浓度和纯度合格的DNA用于下一步的分析。　　2.引物设计　　在 NCBI以及 UCSC网站上查找 ALX4等5个基因外显子序列，利用MethPrimer在线软件对序列进行 CpG岛分析，根据分析结果用 Primer5.0及Methyl primer express软件设计BSP巢式PCR引物，同时利用oligo7.0软件分析引物质量，筛选出合适的引物。　　3. PCR条件的摸索和优化　　分别以结直肠癌患者术中的癌组织和癌旁组织，结直肠患者和健康对照者血浆提取的DNA为模板，经亚硫酸盐处理后，通过优化PCR反应条件和反应试剂组成，确立最优的巢式 PCR方法并对目的基因片段进行有效扩增。同时用癌旁组织DNA作为模板，对P16 exon2片段进行非甲基化PCR扩增，所得扩增产物经琼脂糖凝胶回收纯化及亚硫酸盐处理后，进行甲基化 PCR扩增，将所得产物纯化后作为0%DNA甲基化标准品。根据亚硫酸氢盐测序法(Bisulfite sequencing PCR, BSP)测序结肠癌细胞HCT116和人小肠上皮细胞FHs74Int的P16 exon2甲基化水平，将FHs74Int和HCT116细胞DNA进行亚硫酸盐处理及甲基化PCR，所得甲基化PCR产物纯化后作为50%和100%甲基化标准品。　　4.分析方法验证　　建立 LC-MS/MS分析胞嘧啶及腺嘌呤的方法，进行标准曲线、裂解条件和重复性等验证；检测0%、50%和100%三个DNA甲基化标准品的甲基化率，验证分析方法的可行性和准确性。　　5.样品甲基化分析　　利用建立的方法分析结直肠癌肿瘤组织及癌旁组织，结直肠癌患者血浆及正常人血浆各基因甲基化水平。提取纯化后的样品 DNA，经亚硫酸氢盐转化及甲基化PCR扩增，所得扩增产物经琼脂糖凝胶回收纯化，加入同位素内标与88%甲酸裂解后，离心取上清液用LC-MS/MS进行分析。　　结果：　　1.方法的优化　　1.1 DNA提取　　提取组织DNA时，分别利用天根和QIAGEN公司的基因组DNA提取试剂盒提取的DNA条带清晰、完整性较好，其A260/280都在1.7-1.9，但天根公司的试剂盒性价比更高，因此采用天根的试剂盒提取组织DNA。　　提取血浆DNA时，分别利用天根和QIAGEN公司的血浆DNA提取试剂盒，发现用 QIAGEN提取的血浆 DNA的 A260/280值在1.4左右，纯度比用天根的A260/280值在6.7左右要高很多，并且后续的 PCR产物电泳条带显示，QIAGEN提取的条带清晰单一，天根提取的有杂带，因此采用 QIAGEN公司的试剂盒提取血浆DNA。　　1.2 PCR条件优化　　通过BSP巢式PCR引物的设计以及PCR条件的摸索和优化，成功扩增出组织中ALX4、CNRIP1、HIC1、BCL2和FBN15个基因片段，血浆中ALX4、CNRIP1、和FBN13个基因片段。同时成功制备了0%、50%和100%DNA甲基化标准品。在进行组织DNA PCR扩增时，分别利用TaKaRa Ex Taq和TaKaRa EpiTaqTM HS酶，发现前者的PCR产物电泳条带清晰单一，而后者的PCR产物电泳条带出现重带，故采用TaKaRa Ex Taq酶。　　在进行血浆DNA PCR扩增时，分别利用TaKaRa Ex Taq和TaKaRa EpiTaqTM HS酶，发现前者的PCR产物电泳条带模糊或没有条带，而后者的PCR产物电泳条带清晰单一，故采用TaKaRa EpiTaqTM HS酶。　　1.3 LC-MS/MS分析方法的优化　　利用0%、50%和100% DNA甲基化标准品作为对照。20个 FHs74Int和HCT116细胞BSP甲基化克隆测序所得P16 exon2甲基化水平分别为47.34%和99.38%，3种甲基化标准样 LC-MS/MS分析结果分别为2.00%±2.00%(n=5)，42.90%±1.74%(n=5, RSD=3.15%)，97.25%±2.99%(n=5, RSD=2.40%)，三种DNA甲基化标准品测得值与 BSP测序结果接近；优化胞嘧啶和腺嘌呤的分析方法， Cyt和Ade的线性范围为(5~200)ng/mL，其相关系数R2分别为0.9944和0.9953，表明该分析方法灵敏度、准确性良好。　　2.组织中基因的分析结果　　运用建立的分析方法对结直肠癌患者肿瘤组织和癌旁组织ALX4等5个基因外显子甲基化水平进行检测，结果显示，ALX4、CNRIP、FBN1、HIC1和BCL2在肿瘤组织中的甲基化水平分别是23.70%±10.85%(n=30)、37.03%±13.08%(n=30)、33.23%±6.64%(n=10)、36.83%±13.38%(n=30)、15.46%±2.41%(n=10)，在正常组织中的甲基化水平分别是12.15%±7.08%(n=30)、15.70%±8.19%(n=30)、22.08%±4.46%(n=10)、34.58%±11.15%(n=30)、12.84%±1.91%(n=10)。ALX4、CNRIP1和FBN1在肿瘤组织中的甲基化水平明显高于癌旁组织(p<0.01)，差异有统计学意义，而另外两个基因的甲基化水平在肿瘤组织和癌旁组织中差异无统计学差异(p>0.05)。不同的Dukes分期B期与C期及男性与女性之间，肿瘤组织各基因的甲基化水平差异无统计学意义(p>0.05)。　　3.血浆中基因的分析结果　　运用建立的方法对结直肠癌患者血浆及正常人血浆ALX4等5个基因甲基化水平进行检测，结果显示，ALX4、CNRIP和FBN1在肿瘤血浆中的甲基化水平分别是48.72%±2.91%(n=10)、26.38%±5.46%(n=10)、23.92%±8.01%(n=10)，在正常血浆中的甲基化水平分别是44.12%±2.30%(n=10)、21.81%±6.95%(n=10)、19.33%±5.00%(n=10)。ALX4在肿瘤血浆中的甲基化水平明显高于正常血浆，差异有统计学意义(p<0.01)，而另外两个基因的甲基化水平在肿瘤血浆和正常血浆中差异无统计学差异(p>0.05)。HIC1和BCL2基因不能扩增出预期的PCR产物。结果表明不同血浆样品中ALX4基因的甲基化水平差异有统计学意义。　　ALX4、CNRIP1和FBN1不同的Dukes分期B期与C期及男性与女性之间肿瘤组织各基因的甲基化水平差异无统计学意义(P>0.05)。　　4.不同基因片段在组织和血浆样品中的甲基化水平比较　　ALX4基因癌组织与癌血浆甲基化水平差异有统计学意义(p<0.01)，与正常血浆中该区域甲基化率水平差异有统计学意义(p<0.01)；正常组织与癌血浆中该区域甲基化率水平差异有统计学意义(p<0.01)，与正常血浆中该区域甲基化率水平差异有统计学意义(p<0.01)。　　CNRIP1基因癌组织与癌血浆甲基化水平差异有统计学意义(p<0.01)，与正常血浆中该区域甲基化率水平差异有统计学意义(p<0.01)；正常组织与癌血浆中该区域甲基化率水平差异有统计学意义(p<0.01)，与正常血浆中该区域甲基化率水平差异有统计学意义(p<0.05)。　　FBN1基因癌组织与癌血浆甲基化水平差异有统计学意义(p<0.01)，与正常血浆中该区域甲基化率水平差异有统计学意义(p<0.01)；正常组织与癌血浆中该区域甲基化率水平差异无统计学意义(P>0.05)，与正常血浆中该区域比较甲基化率水平差异无统计学意义(P>0.05)。　　结论：　　1.本研究建立了分析ALX4等5个基因的PCR-LC-MS/MS分析方法。该方法具有快速、灵敏、适用性强等优点，有助于发现高灵敏度和特异性DNA甲基化肿瘤标志物，可为肿瘤的诊断及预后等提供新的手段。　　2.研究结果显示结直肠癌组织 ALX4、CNRIP1和 FBN1外显子区域的甲基化水平显著高于癌旁组织的甲基化水平，差异有统计学意义(P<0.01)，提示组织ALX4、CNRIP1和FBN1基因甲基化物可作为CRC的潜在生物标志物。　　3.研究结果显示血浆 ALX4外显子区域的甲基化水平在肿瘤患者和正常者间差异有统计学意义，血浆样品的ALX4甲基化差异与组织样品具有相同的趋势， 能有效反映区域病灶的发生，提示血浆ALX4甲基化物有望应用于临床结直肠癌早期无创性诊断。