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前胰岛素C肽(CP)可抑制糖尿病并发症,但因在体内半衰期短,故将其与人血清白蛋白基因(HSA)融合,以延长CP药物在体内的半衰期。该融合基因在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达,获得人血清白蛋白-前胰岛素C肽融合蛋白,简称HSA-CP融合蛋白。针对含有HSA-CP融合基因的巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris /HSA-CP)在BSM培养基培养过程中,产HSA-CP融合蛋白量低、易被蛋白酶降解从而导致发酵液中目的蛋白不易被分离纯化等问题,本论文开展了如下研究:对Pichia pastoris /HSA-CP在摇瓶和发酵罐中的发酵条件进行了优化,提高了HSA-CP融合蛋白产量。摇瓶培养条件下,2%浓度的甘油可使菌体细胞干重达10.64g/L,10g/L浓度的甲醇诱导72h得到52.97 mg/L的HSA-CP融合蛋白;7L发酵罐中对Pichia pastoris /HSA-CP进行低密度培养,细胞干重最终为56.43 g/L,目的蛋白产量达368.45mg/L;高密度培养时HSA-CP融合蛋白在发酵液中含量达到707.3mg/L,细胞干重最终为143.09 g/L。探索了减缓蛋白酶降解HSA-CP融合蛋白的方法。发现发酵液中存在内切型蛋白酶对HSA-CP融合蛋白的降解作用,将目的蛋白降解成更小的蛋白片段。加入硫酸铵基本不会减弱蛋白酶对目的蛋白的降解;酪蛋白水解物能减缓蛋白酶对HSA-CP融合蛋白的降解;控制诱导温度在26℃,摇瓶发酵液中蛋白酶活由30℃时的330.9 U/ml降至231.4 U/ml,诱导时在添加1.5%浓度的酪蛋白水解物维持26℃诱导温度的条件下,低密度发酵时蛋白酶活由511.4 U/ml降至442.2 U/ml,而上述方法对高密度发酵影响较小。确定了发酵液中的HSA-CP融合蛋白分离纯化的主要步骤。超滤浓缩20倍,浓缩液中的HSA-CP融合蛋白含量可达7.04g/L,回收率为82.8%。DEAE Sepharose F.F.阴离子交换层析优于Sephadex G-75凝胶过滤纯化HSA-CP融合蛋白的效果,分离得到的目的蛋白经过SDS-PAGE凝胶电泳,获得单一条带,分子量与理论值相符,产品达到电泳纯。Western-blot分析鉴定显示为HSA和CP的融合体。