论文部分内容阅读
本研究通过比较胃癌原发灶与配对淋巴结转移灶中小RNA表达谱,寻找差异表达小RNA,并检测其在胃癌原发灶中的表达量,研究差异表达小RNA与胃癌淋巴结转移的关系。最后通过生物信息学方法预测其靶基因,研究小RNA参与胃癌淋巴结转移的下游通路,旨在为胃癌淋巴结转移机制研究探寻潜在的靶基因。一、激光捕获显微切割纯化肿瘤与RNA质检体系的建立目的：建立激光显微切割纯化肿瘤与微量RNA提取、质检的标准流程,为后续实验提供质量可靠的RNA标本。方法：使用紫外分光光度仪、琼脂糖凝胶电泳、real-time PCR检测不同离体时间正常胃粘膜中RNA降解的情况。选取5例胃癌原发灶及配对淋巴结转移灶,使用激光捕获显微切割获得纯化肿瘤标本,紫外分光光度仪、琼脂糖凝胶电泳、Agilent2100生物分析仪检测纯化标本的RNA质量。结果：抽提自离体时间分别为0’,15’,30’,60’,120’,240’的胃正常粘膜中的总RNA未见明显降解；miR-125b、U6、18S和GAPDH在0’和240’两组中的表达量无明显差异。激光捕获显微切割8um厚切片10mm2能获得606-1038ng的总RNA量,激光捕获显微切割标本中存在总RNA降解。Agilent2100生物分析仪检测见激光捕获显微切割标本中总RNA降解,但小RNA水平未见明显降解。结论：离体时间在240’内的正常胃粘膜中总RNA无明显降解；总RNA水平的降解并不指示小RNA水平的降解；激光捕获显微切割所获总RNA质与量满足后续实验要求。二、胃癌原发灶与淋巴结转移灶间差异表达小RNA筛选及其与淋巴结转移的关系分析目的：寻找胃癌原发灶与配对淋巴结转移灶间差异表达的小RNA,研究差异表达小RNA在胃癌组织标本中的表达情况及其与淋巴结转移的关系。方法：使用小RNA芯片检测5例胃癌原发灶与配对淋巴结转移灶,寻找差异表达的小RNA。使用Stem-loop RT-PCR检测33例胃癌患者术后标本中差异表达小RNA的表达情况,并统计其表达与淋巴结转移的关系。结果：小RNA芯片共检测到5个表达有统计学差异的小RNA,相对原发灶,miR-24-1*、miR-510、miR-1284在淋巴结转移灶中低表达,miR-10a、miR-1259在淋巴结转移灶中高表达。miR-10a、miR-24-1*、miR-510在33例胃癌原发灶中的表达量检测显示,miR-10a在伴有淋巴结转移的原发灶中的表达量低于不伴淋巴结转移的(p=0.047),但在伴淋巴结转移的原发灶中,miR-10a表达量与淋巴结转移程度无相关性。结论：在胃癌原发灶与淋巴结转移灶中检测到miR-10a、miR-24-1*、miR-510、miR-1259、miR-1284等5个差异表达小RNA,其中miR-10a在伴淋巴结转移的胃癌原发灶中较不伴淋巴结转移的表达低,但其表达量与淋巴结转移程度无相关性。三、差异表达小RNA的靶基因预测与筛选目的：预测差异表达小RNA的靶基因,研究小RNA参与胃癌淋巴结转移的下游通路,为后续研究小RNA调控的胃癌淋巴结转移通路提供潜在分子目标。方法：使用TargetScan预测miR-10a、miR-24-1*和miR-510的靶基因,检索已发表的胃癌淋巴结转移相关基因谱或蛋白质谱相关研究,对比优化小RNA的靶基因预测。结果：使用TargetScan分别为miR-10a、miR-24-1*和miR-510预测到186个、438个和62个靶基因。结合已发表文献,进一步筛选得miR-10a靶基因CDK6、TPM4;miR-24-1*靶基因PURA;miR-510靶基因EGR1。结论：经生物信息学方法获得miR-10a靶基因CDK6、TPM4;miR-24-1*靶基因PURA;miR-510靶基因EGR1。四、小结经激光捕获显微切割获得的RNA标本质与量均满足后续小RNA研究的要求。小RNA芯片检测到胃癌原发灶与淋巴结转移灶间miR-10a、miR-24-1*、miR-510、miR-1259、miR-1284等5个差异表达小RNA,其中miR-10a在胃癌原发灶中的表达量与有无淋巴结转移有关,但与淋巴结转移程度无关。生物信息学研究获得miR-10a靶基因CDK6、TPM4;miR-24-1*靶基因PURA;miR-510靶基因EGR1。这四个基因可作为后续胃癌淋巴结转移机制研究的目标,其中miR-10a介导的通路可作为重点关注的对象。