蛇毒是自然界最复杂的天然毒性蛋白混合物之一，具有非常广泛的生物活性，很早就引起国内外科学工作者的注意。去整合素(disintegrins)为一组源自于出血性蛇毒的抗黏附蛋白质的总称，因其可强力拮抗整合素(integrin)而得名。其特征为：富含半胱氨酸，并多含有Arg-Gly-Asp(RGD)或Lys-Gly-Asp(KGD)亲水性氨基酸序列，分子量仅为5～9kD，多为单链蛋白分子。此蛇毒蛋白家族可凭借其分子中RGD序列而成为细胞外基质(ECM)与细胞整合素间结合的强有力的竞争性拮抗剂；因RGD模体能被血小板纤维蛋白原受体仅α<,IIb>β<,3>识别，其还具有抑制ADP诱导的血小板聚集的作用。因此，去整合素可运用于与细胞黏附相关的疾病研究领域，如血管新生、肿瘤转移、血栓症等。关于去整合素的功能研究，国内外已有的相关报道为：台湾的Rhodostomin<[1]>和Accutin<[2]>、韩国的Salmosin<[3，4]>和Saxatilin<[5]>、美国的C0ntortrostatin<[6]>等，这些取自于蛇毒的去整合素均具有抑制血管新生与肿瘤转移，抑制血小板聚集等功效<[1-9]>。 整合素为一细胞表面受体的异源二聚体家族，是一组跨膜糖蛋白，迄今为止已知有18种不同的α亚基和8种不同的β亚基组成至少24种的异源二聚体<[11-12>。α及β亚基的N末端(胞外端)共同构成配体结合位点。因为大部分细胞整合素都识别RGD氨基酸顺序，而大多数ECM蛋白都含有RGD顺序，所以RGD序列已被公认为是ECM成分与细胞整合素结合的位点<[13]>。整合素胞内部分较短，但可以通过α-辅肌动蛋白(α-actinin)、踝蛋白(talin)和黏着斑蛋白(vinculin)与细胞骨架相连。整合素主要介导细胞之间及细胞与ECM之间的黏附，并介导细胞与ECM之间的双向信号传导，对细胞的黏附、增殖、分化、转移、凋亡起到重要的调控作用，在肿瘤的侵袭转移中发挥重要作用<[14]>。整合素仪αvβ3是其中的一种重要分子。许多研究表明，整合素α<,v>β<,3>与肿瘤侵袭转移有关。在整合素活化和聚集成簇的位点，蛋白质聚集成黏着斑复合体而与细胞内表面相连。这些复合体是细胞应答周围环境而产生张力的位点，其可以使细胞改变形状并实现复杂的细胞迁移和细胞分裂等过程<[10]>。目前看来，整合素的主要信号转导途径是酪氨酸磷酸化级联反应。整合素α<,v>β<,3>与配体结合后，早期是通过使黏着斑激酶(foeal adhesion kinase，FAK)酪氨酸磷酸化而使其激活，活化的FAK激活胞内多条信号转导通路，如JNK、p38MAPK、Ras-MAPK。引发其他细胞骨架蛋白和信号蛋白的酪氨酸磷酸化，这些磷酸蛋白对调节细胞功能起重要作用。因此，FAK被认为是整合素依赖性信号转导通路的基础分子，在整合素介导的信号转导通路中起着至关重要的作用<[15]>；整合素α<,v>β<,3>与配体结合后，还可激活整合素连接激酶(ILK)，促进细胞周期循环的进行，抑制细胞的凋亡<[16]>。 目前研究较清楚的是Ras-MAPK通路。FAK有6个磷酸化位点(Tyr397，407，576，577，681，925)，它们是FAK发挥传导功能的关键部位<[17]>。FAK自身磷酸化位点与src家族相互作用，使体外FAK激酶活性增加到最大限度，出现Grb<,2>活性位点，再与SOS结合，进入Ras-MAPK通路<[181]>。 由此可见，阻断整合素的信号转导通路，将引起一系列细胞生理活动的改变。而蛇源去整合素因其可强力拮抗整合素无疑会在其中扮演重要角色。鉴于以往对整合素功能及作用机制的相关报道，本文对产于中国旅顺的白眉蝮蛇去整合素进行了研究。 本实验室已经从产于中国旅顺的白眉蝮蛇(Gloydius blomhoffibrevicaudus)毒腺中提取出总RNA，利用自行设计的引物进行RT-PCR扩增，获得了219bp的白眉蝮蛇去整合素基因。测序结果显示，其与韩国的蝮蛇去整合素的saxatilin的同源性最高：DNA序列同源性为95.8﹪，蛋白质序列同源性为 91.8﹪，且蛋白质中含有去整合素的特征模体RGD及 12 个半胱氨酸。将此去整合素基因进行克隆、转化与诱导后，得到了该蛋白的可溶性高效表达。经组氨酸亲和层析纯化，获得了分子量为9kD的均质蛋白，并将其命名为Adinbitor。 本文在上述研究成果的基础上，对蛇源去整合素Adinbitor的作用机制进行了初步探讨。主要做了以下几方面的工作： 1．将已成功构建的重组表达菌BL21/pET23b-adinbitor进行IPTG诱导表达：将可溶性蛋白成分经组氨酸亲和层析柱对其进行纯化，行Tricine-SDS PAGE对蛋白鉴定，成功获得了分子量为9kD的均质蛋白rAdinbitor。每升诱导培养物可获3.6mg纯化的rAdinbitor. 2.rAdinbitor剂量依赖性抑制C6细胞增殖的试验结果表明：rAdinbitor与抗αvβ<,3>单克隆抗体的作用类似，提示rAdinbitor的作用位点可能是整合素αvβ<,3>；rAdinbitor抑制C6细胞增殖的半数抑制浓度(medianinhibitory concentration，IC<,50>)为2.75μmol/L。rAdinbitor作用C6细胞的Caspase-3(胱天蛋白酶-3)——细胞凋亡蛋白水解酶表达量分析，rAdinbitor很可能通过Caspase-3途径诱导C6细胞发生凋亡。 3.通过rAdinbitor对FAK-Ras-MAPK信号转导通路中FAK、Ras、MEK、ERK各激酶表达及磷酸化的结果表明，rAdinbitor可有效抑制FAK表达及磷酸化；对Ras的表达成促进作用：而对MEK、ERK的表达则为剂量性抑制作用。这充分证明rAdinbitor的信号转导途径是通过抑制整合素avl3 3的信号转导来实现的，通过封闭ECM与整合素的作用位点，阻止黏着斑形成对整合素的信号转导通路起阻滞作用，进而引起细胞凋亡等一系列反应。 总之，本论文成功获得了rAdinbitor纯化蛋白，并较为系统的对FAK-Ras-MAPK信号转导通路进行了研究。实验结果提示了蛇源去整合素Adinbitor作为一种抗肿瘤或抗血栓新药的潜在应用价值，并为临床治疗肿瘤开辟新思路和提供新的药物作用靶点。