论文部分内容阅读
细菌纤维素(Bacterial Cellulose,BC)是一种由一些微生物菌株代谢产生的胞外多糖。由于其纯度高、具有优良的理化性能,被广泛应用于食品、医疗、化工等领域。由于BC的生产成本偏高,限制了其广泛应用。因此获得高产、优质的BC生产菌株,最大限度发挥BC产生菌的合成能力,是降低BC生产成本、扩大应用的基础。本文对来自红茶菌的一株产BC的新菌种莱蒂亚驹形杆菌315(Komagataeibacter rhaeticus 315,简称K.rhaeticus 315)进行了全基因组分析,在了解其代谢特征的基础上,通过优化能量供给方式,弱化分支代谢通路,提高BC合成前体—葡萄糖的转化率,为降低BC的生产成本奠定基础。此外,鉴于BC产生菌具有界面合成的特征,本文还对发酵方式和条件进行了研究。具体研究结果如下:(1)K.rhaeticus 315全基因组数据表明,K.rhaeticus 315全基因组大小为3.70 Mbp,平均覆盖率470X,GC含量63.98%,其中预测编码DNA序列数(CDS)为3314条。该菌株的基因组序列中缺乏磷酸果糖激酶的编码基因,不能通过EMP途径代谢葡萄糖产生能量。此外,该菌株具有多个葡萄糖脱氢酶的编码基因。发酵过程代谢产物的分析表明,在以葡萄糖为唯一碳源时,菌株通过氧化葡萄糖生成葡萄糖酸来获得能量,体系中有大量葡萄糖酸积累(发酵20 d浓度为32.25 g/L)。因此本文构建了葡萄糖脱氢酶基因缺失体重组株(gcd~-),结果表明,葡萄糖酸的生成量降低了77%,该基因的敲除对降低葡萄糖到葡萄糖酸的通路有一定的帮助;重组菌株的耗糖量也比原始菌株降低了42.1%,该基因敲除可降低BC合成前体物质葡萄糖的消耗,对碳源的节省有积极作用。(2)考察了能量供给方式对BC合成的影响。结果表明,葡萄糖最有利于BC的合成,产量可达1.51 g/L;乙醇对BC的合成具有促进作用,当添加2%乙醇时,BC产量可达6.60 g/L,提高了4.37倍。当葡萄糖作为唯一碳源时(即不添加乙醇),菌体需要利用葡萄糖转化成葡萄糖酸来供能,合成BC的前体物质—葡萄糖被大量消耗,BC产量降低;加入乙醇后,菌株可以通过氧化乙醇产生乙酸来提供能量,葡萄糖主要流向BC合成。因此,能量供给方式对菌株合成BC有较大影响。通过分析转录组的数据,考察了乙醇的其他影响机制。结果表明,乙醇除了氧化供能,同时还会影响菌株代谢途径中关键酶的基因转录水平,使HMP途径中关键酶和葡萄糖脱氢酶的基因转录水平下调,BC合成途径中关键酶的基因转录水平上调,这与代谢流的走向一致。(3)BC合成是一个需氧过程,且具有界面合成的特征,因此供氧方式和气液接触面积对BC产量有较大影响。结果表明,摇瓶发酵虽然能提高发酵液的溶解氧,但剧烈搅拌不利于BC合成。由于菌体具有迁移性和趋氧性,BC在气液界面不断合成,因此采用静置间歇沉膜式培养,BC产量提高了2.3倍。K.rhaeticus 315发酵过程的研究表明,在发酵4 d后体系中的残糖水平较低,这会影响发酵后期BC的合成,因此,本文考察了间歇式补料发酵对BC产量的影响。结果表明,初始葡萄糖浓度为20 g/L,初始乙醇添加量为2%时,每隔4 d补加5 g/L葡萄糖以及2%乙醇,BC产量在发酵12 d后达到11.17 g/L,较优化前BC产量提高了1.49倍。(4)本文对K.rhaeticus 315所产BC膜的基本特征进行表征。结果显示,BC膜具有典型的纤维素Ι型结构特征,结晶度为88.23%,具有良好的热稳定性、拉伸性、复水性和持水性。