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转Bt基因抗虫棉花(Bt棉)自1997年在我国商业化以来，对红铃虫、棉铃虫等主要靶标害虫起到了很好的控制作用，但Bt棉的连续大规模种植对靶标害虫造成了持续的选择压，尤其是对食性单一的红铃虫。近年来，我国长江流域红铃虫田间种群曾出现对Bt棉的抗性倍数显著上升的情况，这将对长江流域Bt棉的使用寿命构成威胁。解决这个问题之前，长江流域红铃虫对Bt棉的抗性水平后续如何变化及对Bt棉的抗性机制等问题仍有待进一步研究。为此，本研究以红铃虫室内品系和田间种群个体为材料，对我国长江流域红铃虫田间种群进行了Cry1Ac敏感性测定和抗性基因频率分子检测，从田间种群中筛选、建立了两个红铃虫Cry1Ac抗性品系，对其携带的抗性等位基因进行克隆、鉴定和遗传分析，从基因、遗传、蛋白等水平揭示其抗性机制，并建立DNA检测的抗性监测方法。本文主要研究结论如下：
1.Cry1Ac敏感性测定结果表明，与前人2008-2010年的抗性监测结果相比，长江流域红铃虫田间种群对Bt棉的敏感性有所恢复。2012-2015年该流域红铃虫各地方种群对Cry1Ac的年度平均LC50在0.23-0.27μg/mL之间。年度平均抗性倍数在3.2-4.5倍之间(平均值为3.8)，且呈现出先升高后降低的趋势。
2.抗性基因频率检测结果表明，长江流域红铃虫对Bt棉的抗性处于较低水平。对长江流域红铃虫7个钙粘蛋白抗性等位基因(r1, r2, r3, r13, r14, r15, r16)的检测结果显示，2012-2015年长江流域总的抗性等位基因频率分别为0.0105、0.0044、0.0023、0.0046，总体在10-3~10-2的数量级。与2012年相比，2013-2015年长江流域红铃虫的抗性基因频率显著下降。在检测到的175个抗性个体携带的194个抗性等位基因中，r1占所有抗性等位基因总数的71%，是长江流域红铃虫种群中的主导抗性等位基因；除r3未检测到外，其余抗性等位基因均有发现。
3.通过F1检测法和F2检测法建立单对系进行抗性筛选，从田间种群中筛选获得两个红铃虫Cry1Ac抗性品系——TM6和AQ17。二者对Cry1Ac分别有281.6倍和278.5倍的抗性，对Cry2Ab无交互抗性，对Vip3Aa不敏感。正反交实验结果表明TM6与AQ17对Cry1Ac的抗性遗传方式为常染色体偏隐性遗传，回交实验结果表明TM6、AQ17品系红铃虫与Cry1Ac抗性紧密连锁。
4.钙粘蛋白等位基因r17与r18的CR区缺失突变介导了红铃虫TM6与AQ17品系对Cry1Ac的抗性。r17与r18的cDNA全长分别为5206bp和4051bp，相比野生型分别缺失了2bp和1157bp。因非3倍数的缺失造成移码突变提前引入终止密码子，导致r17与r18分别只编码211AA和1278AA，二者均缺失部分钙粘蛋白重复区、近膜区、跨膜区和胞内区等结构。r17、r18的gDNA上的碱基缺失和替换造成各自mRNA的碱基缺失或外显子/内含子剪接识别错误。
5.采用昆虫细胞系TnH5对抗性基因r17与r18进行了功能验证。亚细胞定位结果显示，细胞表达的对照组sPgCad1-EGFP融合蛋白均定位在细胞膜上；细胞表达的r17PgCad1-EGFP与r18PgCad1-EGFP融合蛋白均不能正确锚定在细胞膜上，而是定位在内质网上，定位错误导致蛋白丧失受体与Cry1Ac毒素结合的功能。细胞毒力测定实结果表明，r17、r18与Cry1Ac抗性相关。表达r17PgCad1-EGFP与r18PgCad1-EGFP融合蛋白的TnH5细胞对40μg/mL的Cry1Ac处理不敏感，而表达sPgCad1-EGFP融合蛋白的细胞对10μg/mL的Cry1Ac处理表现出膨大、破裂的病变现象，表明前者对Cry1Ac产生抗性。
6.棉铃生物测定结果表明，红铃虫TM6与AQ17品系的Cry1Ac抗性与Bt棉的田间抗性相关。两个抗性品系的红铃虫在GK19、CV163和Simian3这三种棉铃上均可以存活，但敏感品系红铃虫AS只能在Simian3上存活。相对于在常规棉Simian3棉铃上的存活情况，TM6与AQ17品系在两种Bt棉上存活率降低、幼虫发育历期延长、蛹重降低、单雌产卵量降低。
7.建立了钙粘蛋白抗性等位基因r17与r18的分子检测方法。根据钙粘蛋白抗性等位基因r17、r18的gDNA突变位点与野生型基因序列的差异，设计了基因特异性引物，用于红铃虫田间种群抗性基因r17、r18的检测和基因型鉴定。
以上结果阐明了我国长江流域红铃虫对Cry1Ac的敏感性及其抗性基因频率的年度变化，明确了钙粘蛋白抗性基因r17、r18突变介导了红铃虫对Cry1Ac的抗性机制，丰富了红铃虫对Bt棉田间抗性的监测手段。本研究为制定科学合理的红铃虫对Bt棉花抗性的治理决策提供了科学参考。
1.Cry1Ac敏感性测定结果表明，与前人2008-2010年的抗性监测结果相比，长江流域红铃虫田间种群对Bt棉的敏感性有所恢复。2012-2015年该流域红铃虫各地方种群对Cry1Ac的年度平均LC50在0.23-0.27μg/mL之间。年度平均抗性倍数在3.2-4.5倍之间(平均值为3.8)，且呈现出先升高后降低的趋势。
2.抗性基因频率检测结果表明，长江流域红铃虫对Bt棉的抗性处于较低水平。对长江流域红铃虫7个钙粘蛋白抗性等位基因(r1, r2, r3, r13, r14, r15, r16)的检测结果显示，2012-2015年长江流域总的抗性等位基因频率分别为0.0105、0.0044、0.0023、0.0046，总体在10-3~10-2的数量级。与2012年相比，2013-2015年长江流域红铃虫的抗性基因频率显著下降。在检测到的175个抗性个体携带的194个抗性等位基因中，r1占所有抗性等位基因总数的71%，是长江流域红铃虫种群中的主导抗性等位基因；除r3未检测到外，其余抗性等位基因均有发现。
3.通过F1检测法和F2检测法建立单对系进行抗性筛选，从田间种群中筛选获得两个红铃虫Cry1Ac抗性品系——TM6和AQ17。二者对Cry1Ac分别有281.6倍和278.5倍的抗性，对Cry2Ab无交互抗性，对Vip3Aa不敏感。正反交实验结果表明TM6与AQ17对Cry1Ac的抗性遗传方式为常染色体偏隐性遗传，回交实验结果表明TM6、AQ17品系红铃虫与Cry1Ac抗性紧密连锁。
4.钙粘蛋白等位基因r17与r18的CR区缺失突变介导了红铃虫TM6与AQ17品系对Cry1Ac的抗性。r17与r18的cDNA全长分别为5206bp和4051bp，相比野生型分别缺失了2bp和1157bp。因非3倍数的缺失造成移码突变提前引入终止密码子，导致r17与r18分别只编码211AA和1278AA，二者均缺失部分钙粘蛋白重复区、近膜区、跨膜区和胞内区等结构。r17、r18的gDNA上的碱基缺失和替换造成各自mRNA的碱基缺失或外显子/内含子剪接识别错误。
5.采用昆虫细胞系TnH5对抗性基因r17与r18进行了功能验证。亚细胞定位结果显示，细胞表达的对照组sPgCad1-EGFP融合蛋白均定位在细胞膜上；细胞表达的r17PgCad1-EGFP与r18PgCad1-EGFP融合蛋白均不能正确锚定在细胞膜上，而是定位在内质网上，定位错误导致蛋白丧失受体与Cry1Ac毒素结合的功能。细胞毒力测定实结果表明，r17、r18与Cry1Ac抗性相关。表达r17PgCad1-EGFP与r18PgCad1-EGFP融合蛋白的TnH5细胞对40μg/mL的Cry1Ac处理不敏感，而表达sPgCad1-EGFP融合蛋白的细胞对10μg/mL的Cry1Ac处理表现出膨大、破裂的病变现象，表明前者对Cry1Ac产生抗性。
6.棉铃生物测定结果表明，红铃虫TM6与AQ17品系的Cry1Ac抗性与Bt棉的田间抗性相关。两个抗性品系的红铃虫在GK19、CV163和Simian3这三种棉铃上均可以存活，但敏感品系红铃虫AS只能在Simian3上存活。相对于在常规棉Simian3棉铃上的存活情况，TM6与AQ17品系在两种Bt棉上存活率降低、幼虫发育历期延长、蛹重降低、单雌产卵量降低。
7.建立了钙粘蛋白抗性等位基因r17与r18的分子检测方法。根据钙粘蛋白抗性等位基因r17、r18的gDNA突变位点与野生型基因序列的差异，设计了基因特异性引物，用于红铃虫田间种群抗性基因r17、r18的检测和基因型鉴定。
以上结果阐明了我国长江流域红铃虫对Cry1Ac的敏感性及其抗性基因频率的年度变化，明确了钙粘蛋白抗性基因r17、r18突变介导了红铃虫对Cry1Ac的抗性机制，丰富了红铃虫对Bt棉田间抗性的监测手段。本研究为制定科学合理的红铃虫对Bt棉花抗性的治理决策提供了科学参考。