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背景卵巢癌是妇科恶性肿瘤中最常见一种,其死亡率居于女性生殖系统癌症的首位。卵巢癌转移是其具有高死亡率最重要的原因,很多患者到了癌症晚期才被确诊为卵巢癌,此时肿瘤已经广泛转移到体内的多个部位,因此会导致不良预后。目前,卵巢癌的标准治疗方案是通过手术加以铂类药物辅助,尽管治疗手段在生物技术上取得了很大的进展,但是患者出现的耐药性及复发性仍然是亟待解决的问题。因此,寻找治疗卵巢癌的新靶点,开发卵巢癌诊疗的新方法显得尤为重要。核蛋白(PEST Proteolytic Signal Containing Nuclear Protein,PCNP)在2004 年由日本科学家首次提出,作为NIRF的底物参与到蛋白质的泛素化过程。该蛋白主要位于细胞核中,含丰富的PEST序列,而富含PEST序列的大多数蛋白质参与细胞周期进程,调节细胞增殖。由此我们猜测核蛋白PCNP可能参与调节肿瘤发展的过程。人类蛋白质基因表达图谱网站数据显示,富含PEST序列的核蛋白PCNP在卵巢癌、宫颈癌、直肠癌、皮肤癌、胃癌、甲状腺癌的恶性肿瘤细胞中表达均高于正常组织。目前国内外暂未出现核蛋白PCNP对卵巢癌发展进程中的调控作用及机制的相关研究,为了解PCNP在卵巢癌发生发展中的潜在功能,本研究探讨了 PCNP对人卵巢癌细胞增殖和转移的影响及潜在的分子机制,旨在为改善卵巢癌预后开发卵巢癌诊疗策略提供新思路。目的探讨核蛋白PCNP对卵巢癌发生发展的影响,初步研究其潜在的作用机制。方法查阅TCGA等相关数据库,分析核蛋白PCNP在卵巢癌病理过程中对患者生存期及预后的影响;用IHC评分法分析核蛋白PCNP在人卵巢癌和正常组织中的蛋白表达水平,并分析蛋白表达水平与卵巢癌发展的关系。利用G418药物和嘌呤霉素进行药物敏感性试验,筛选杀死细胞的最低药物浓度。构建PCNP过表达质粒、过表达对照质粒以及PCNP敲低质粒、敲低对照质粒。在人卵巢癌上皮细胞系SK-OV-3和A2780中分别转入四种质粒,并利用药物敏感性试验的结果筛选稳定细胞株。通过Western blot和q-PCR试验,在蛋白质表达水平以及mRNA表达水平上验证是否成功构建稳定转染的细胞株。使用细胞划痕愈合试验和Transwell试验检测人卵巢癌细胞的迁移能力;Invasion试验和软琼脂试验检测人卵巢癌细胞的侵袭能力;TUNEL法检测人卵巢癌细胞的凋亡能力;Western blot检测相关凋亡蛋白的表达水平。同时,Western blot也被用来检测Wnt/β-catenin信号通路蛋白、PI3K/AKT/mTOR信号通路蛋白以及相关EMT蛋白的表达水平。免疫共沉淀实验以及放线菌酮实验分别检测PCNP与β-catenin的相互作用关系及PCNP对β-catenin稳定性的影响。将处理过的各种卵巢癌稳定细胞株注射到裸鼠中以检测PCNP对裸鼠成瘤性的作用,从试验组裸鼠体内取出瘤块及肺部组织,进行HE染色和免疫组织化学分析以检测PCNP在体内对卵巢癌发展进程的影响。结果1.核蛋白PCNP主要在细胞核中表达;PCNP在卵巢癌组织中的表达量高于正常组织。2.成功构建了两种人卵巢癌上皮细胞系的PCNP过表达组、敲低组和空白载体对照组的稳定细胞株。3.EDU试验和平板克隆试验表明PCNP过表达促进人卵巢癌上皮细胞SK-OV-3和A2780细胞的增殖和生存能力;PCNP敲低则抑制卵巢癌上皮细胞的增殖和生存能力。4.TUNEL染色试验结果表明PCNP过表达抑制人卵巢癌细胞凋亡,敲低则促进细胞凋亡。5.划痕愈合试验、Transwell试验结果显示PCNP过表达可以增强人卵巢癌细胞的迁移能力;PCNP敲低可减弱细胞迁移能力。Invasion和软琼脂试验结果表明PCNP增强了人卵巢癌细胞的侵袭能力;PCNP敲低可减弱细胞侵袭能力。6.蛋白免疫印迹的结果显示PCNP过表达可以增加人卵巢癌细胞中EMT相关蛋白N-cadherin和ZEB1蛋白表达,同时降低了 E-cadherin的表达水平;PCNP敲低组则具有相反的效果。7.蛋白免疫印迹的结果显示,在人卵巢癌细胞中,PCNP过表达组Cleaved-caspase8、Cleaved-caspase9、Cleaved-PARP 的表达水平降低,而β-catenin 和 p-GSK-3β、p-AKT、p-PI3K表达水平升高;敲低组的结果则相反,因此PCNP可能是通过Wnt/β-catenin信号通路介导人卵巢癌细胞的凋亡。8.免疫共沉淀试验以及放线菌酮试验结果显示PCNP可能与β-catenin相互作用,促进了β-catenin的易位表达,进一步激活的Wnt/β-catenin信号通路。9.裸鼠皮下移植肿瘤模型试验表明PCNP促进人卵巢癌异种移植瘤的生长与血管形成。结论核蛋白PCNP在人卵巢癌上皮细胞系SK-OV-3和A2780中高表达,且与卵巢癌的不良预后呈正相关。核蛋白PCNP可能通过激活经典的Wnt/β-catenin信号通路与β-catenin相互作用,促进了 β-catenin在细胞核中发生累积,增强卵巢癌细胞的增殖、转移和侵袭能力,进而影响人卵巢癌的发生发展。