芯片技术在研究血红蛋白特异性抗原及特异性定量测定血红蛋白中的应用

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本文利用抗原抗体反应的特异性以及蛋白质芯片定量测定的特点,建立了血红蛋白抗原芯片和抗血红蛋白抗体芯片两种不同的蛋白质芯片检测方法。用westrn blot和抗原芯片法定性定量地研究了人、牛、猪血红蛋白主要抗原决定簇的异同性。此外,对抗原芯片和抗体芯片定量测定戊二醛聚合猪血红蛋白的特性进行了比较研究。利用抗原抗体特异性结合反应的特点,本研究测定了某一特定抗血红蛋白抗体与不同来源的血红蛋白之间的抗原抗体交叉结合反应,以确定不同来源血红蛋白的主要抗原决定簇的异同性,并用抗原芯片法定量测定交叉反应的程度。利用鼠源性抗血红蛋白抗体进行的westrn blot定性检测表明,某特定鼠源性抗血红蛋白抗体在人、牛或猪血红蛋白之间的交叉反应程度较低。用抗原芯片方法定量检测兔源性抗血红蛋白抗体在人、牛或猪血红蛋白的交叉反应十分微弱。兔抗猪血红蛋白抗体几乎不识别人或牛血红蛋白,交叉反应率为3.5%以下;兔抗牛血红蛋白抗体与人、猪血红蛋白的交叉反应率也较低,分别为4%和6%左右;不过,兔抗人血红蛋白抗体与牛血红蛋白有较明显的交叉结合反应,最大可达24.77%,与猪血红蛋白的交叉反应率低于7.5%。此外,抗原芯片方法定量检测结果还表明由大鼠产生的相应抗人,牛或猪血红蛋白的抗体大多不产生或产生很弱的抗原抗体交叉结合反应。实验还发现,Mg2+离子可抑制兔源性抗血红蛋白抗体与其特异血红蛋白的结合反应,但是其抑制程度随血红蛋白来源不同而异。Mg2+离子对戊二醛聚合猪血红蛋白和其兔源性抗体的结合反应抑制最大,抑制率可达85%以上;牛血红蛋白与其兔源性抗体的结合反应受Mg2+离子的抑制作用较小,抑制率约为50%左右;Mg2+离子对戊二醛聚合人血红蛋白和其兔源性抗体的结合反应抑制最弱,抑制率不到20%。此研究结果表明,虽然人、牛、猪血红蛋白的氨基酸序列高度保守,此三类血红蛋白具有相互独立的主要抗原决定簇。本文对抗原芯片和抗体芯片定量测定戊二醛聚合猪血红蛋白的基本特性(包括线形特征和范围,灵敏度)以及在体液中检测戊二醛聚合猪血红蛋白类制品的应用的比较研究发现,这两种方法都具有高度特异性,是目前唯一一种可用来区别不同种属来源的血红蛋白及其衍生物的检测方法。其线性范围一般在1-12μg/mL,灵敏度为0.5μg/mL,比目前所报道的灵敏度最高的血红蛋白检测方法——液相色谱—质谱—质谱联用法高250倍。抗原芯片测定戊二醛聚合猪血红蛋白线性效果良好,通量较高,但受体液成分干扰较大,体液样品必须50倍稀释后才可用于检测,体液样品检测的灵敏度为25μg/mL。而抗体芯片的检测则不受体液成分干扰,体液样品可不经稀释直接测定,因此,其灵敏度比抗原芯片高50倍左右,但线性关系较差。
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