研究背景：端粒是近年来生命科学研究的热点之一,随着相关研究的不断深入,已逐渐引起国内外血液病工作者的关注。端粒长度缩短和端粒酶相关基因突变可以导致造血干细胞衰老,严重影响造血干细胞的植入效率,是骨髓衰竭性疾病的发病原因之一。再生障碍性贫血(aplastic anemia, AA)是最常见的骨髓衰竭性疾病,主要表现为骨髓造血功能低下,造血干祖细胞数量减少伴功能异常,导致全血细胞减少。AA病因及发病机制极为复杂,呈现高度异质性,传统观点认为其机制可以归纳为“种子、土壤、虫子”学说,即“造血干细胞的损伤、造血微环境的异常以及免疫功能紊乱”。近年来普遍认为AA是一种以造血干祖细胞为靶向的自身免疫性疾病,约70%的患者经免疫抑制治疗(immuno suppressive therapy,IST)获得改善,而仍有约30%的AA患者应用IST无效,这部分患者发病机制可能另有原因。近年研究发现AA的发病表现出一定的宿主遗传易感性,特别是一些关于端粒长度、端粒酶相关基因突变等研究发现,端粒酶基因突变可导致酶活性的减低,加速端粒缩短,使造血前祖细胞增殖能力下降。端粒是真核细胞线性染色体的末端,由DNA3’端的6个核苷酸短串联重复序列(5’TTAGGG3’)及其互补序列构成的双链结构,其富含T、G碱基,由DNA及其相关蛋白组成。端粒为非结构基因,不编码蛋白质,是细胞进化过程中一段高度保守的序列,端粒可保护染色体不被核酸酶降解、防止染色体末端相互融合,在维持染色体完整方面发挥了重要的作用。目前发现有两种端粒长度调控机制,主要为端粒酶途径以及端粒延长替代机制(Alternative lengthing of telomere,ALT)。端粒酶是一种自身携带模板的逆转录酶,为RNA模板及具有催化调控功能的各种蛋白亚基构成的核糖核蛋白复合体,端粒酶能以自身RNA为模板,通过逆转录机制合成(TTAGGG)n序列,即于端粒末端添加DNA重复序列,以抵消或延缓细胞分裂活动引起的末端缩短问题。既往研究发现,部分AA患者存在端粒缩短情况,且这部分端粒缩短的AA患者疾病持续时间更长,治疗后更易复发,进展为晚期恶性克隆性疾病的可能性更大,如转化MDS、PNH和AML等。也有研究发现,大多数存在端粒酶突变的AA患者,临床上对IST治疗多不敏感,但没有同时检查端粒酶活性,并按照疗效分组比较及统计,且端粒酶突变检测阳性率较低,费用高,临床应用受到局限。基于端粒与AA的相关性,以往研究检测标本多为外周血白细胞或粒细胞,外周血白细胞主要由单个核细胞及粒细胞组成,AA患者粒细胞缺乏,标本不易获得,然而AA患者多伴有淋巴细胞比例增加,因而本研究取外周血单个核细胞作为标本来源。选取近年来发展的流式-荧光原位杂交法(Flow-FISH),利用端粒特异性探针(PNA)检测端粒长度的新方法,其与既往Southern blot、Q-PCR等方法有很好的相关性,且所需样品量少(细胞数少于105个),灵敏度高,可以检测出小于3kb的端粒长度,操作快捷,特异性强,重复性好,并同时采用TRAP-PCR-ELISA方法检测标本细胞端粒酶活性。目的：观察再生障碍性贫血患者外周血单个核细胞的端粒长度、端粒酶活性的变化,探讨端粒长度及端粒酶活性变化在AA发病机制中的作用,寻找AA治疗的新靶点。观察AA患者端粒长度与IST治疗疗效的关系,了解AA患者的端粒长度对于评估常规IST治疗疗效及预后的意义,为其尽早选择合适的治疗方案提供理论依据。方法：(1)研究对象,选取2010年9月至2013年3月广州军区广州总医院、广州市第一人民医院、广州市第十二人民医院、广东药学院第一附属医院、中山大学附属第一医院等多家医院血液科确诊的71例AA患者,男性36例,女性35例,平均年龄39.48±18.78岁(12-82岁),其中NSAA组35例,SAA组26例,VSAA组10例,于初诊时留取外周血标本3ml (EDTA)。同时选取性别及年龄与之匹配的34例门诊健康体检者作为正常对照组,其中男性17例,女性17例,平均年龄40.68±19.00岁(10-73岁),亦留取外周血标本3ml(EDTA)。IST标准方案为ATG联合CSA。诊断及疗效标准参考2009年英国再生障碍性贫血诊疗指南,本研究取得患者本人或其家属的同意并签订知情同意书。(2)采用流式-原位杂交法(Flow-FISH)检测相对端粒长度,培养MOLT-4细胞株做内对照细胞,被检测标本分别于含FITC-PNA探针和不含FITC-PNA探针的杂交液混合杂交,经孵育、洗涤、染色后应用流式细胞仪检测端粒长度,端粒长度以待测外周血单个核细胞标本相对于同批上机的MOLT-4内对照细胞株的平均荧光强度的百分比值表示,根据公式计算相对端粒长度(relative telomere length, RTL)=(带FITC-PNA探针样品细胞的平均FLl值—不带FITC-PNA探针样品细胞的平均FL1值)×对照细胞的DNA指数×100/(带FITC-PNA探针对照细胞的平均FL1值—不带FITC-PNA探针对照细胞的平均FL1值)×DNA样品细胞的DNA指数。采用TRAP-PCR-ELISA法检测AA患者的端粒酶活性,样品相对端粒酶活性(RTA),根据公式RTA=(AS-ASO)/AS.IS/(ATS8-ATS8.0)/ATS8.IS*100, RTA>0.2为端粒酶阳性,观察AA患者PBMNC端粒长度与IST疗效的关系。(3)应用SPSS16.0软件统计分析数据,计量资料均以(x±s)表示,多因素分析应用线性回归；多组间比较采用单因素方差分析,当方差不齐时采用近似F检验Welch法；多重比较时方差齐采用LSD法,方差不齐采用Dunnett’T3。计数资料以率表示,组间比较采用卡方检验或Fisher精确概率检验。检验水准α=0.05,双侧检验。结果：(1)研究对象分为正常对照组、NSAA组及SAA+VSAA组。PBMNC端粒长度与相关因素的线性回归分析发现,不同性别者PBMNC端粒长度无显著差别(t=0.548,P=0.585),性别与诊断的交互作用不显著(t=--0.580,P=0.563),即各组中性别对外周血端粒长度均无显著影响。(2)正常对照组、NSAA组及SAA+VSAA组中,外周血端粒长度与年龄呈负相关(b=-0.387,P=0.001),即都随年龄的增长而缩短,而不同组间比较,正常对照组端粒长度随年龄增长下降幅度要稍大于其他两组(NSAA、SAA+VSAA组),NSAA组与SAA+VSAA组端粒长度随年龄变化的趋势一致。(3)控制了年龄对外周血端粒长度的影响,采用多重比较发现,NSAA、SAA+VSAA组外周血端粒长度均显著短于正常对照组(P均<0.001)。(4)端粒酶活性检测对象选取NSAA组23例,SAA+VSAA组28例,性别年龄与之匹配的34例正常对照组,分组检测示34例正常对照组中端粒酶阳性6例(17.6%),23例NSAA组中端粒酶阳性11例(47.8%),28例SAA+VSAA组中端粒酶阳性21例(75.0%)。三组端粒酶活性有显著差别(F=20.385,P<0.001)。多重比较示SAA+VSAA组(P<0.001)、NSAA组(P=0.002)端粒酶活性均显著高于正常对照组,约为正常对照组端粒酶活性的2-3倍。随机选取7例,其中正常对照组2例,SAA患者5例,通过测序法检测端粒酶TERT部分的6个突变位点,并根据NCBI数据库资料进行序列对比,结果显示检测的7例标本,均无突变。(5)71例AA患者经过IST治疗,35例NSAA组中完全有效组(CR)14例(40.0%),部分有效组(PR)16例(45.7%),无效组(NR)5例(14.3%)；36例SAA+VSAA组中CR11例(30.6%),PR16例(44.4%),NR9例(25.0%)。(6)采用方差分析和卡方检验比较发现,不同性别患者间的疗效无显著性差别(X2=2.3975, P=0.302), NSAA组与SAA+VSAA组间疗效无显著性差别(X2=1.489,P=0.475)。而年龄对疗效有影响(F=3.138,P=0.05),鉴于P=0.05,采用线性回归方程,调整了年龄对外周血端粒长度的影响,方差分析发现不同疗效组与对照组间的外周血端粒长度有显著性差别(F=4.615,P=0.003),多重比较示,NR组的外周血端粒长度显著低于正常对照组(P=0.005), PR、CR组跟正常对照组相比均无显著差别(P=0.517,P=0.254)。当AA患者PBMNC端粒长度低于界值点29.21时,将显著影响IST疗效,无效病例明显增多。结论：AA患者PBMNC端粒长度与正常对照组相比显著缩短,可直接导致其骨髓增殖能力降低,而与其低增生状态不同的是,AA患者PBMNC端粒酶活性不低反而升高,且IST无效组的外周血端粒长度显著低于正常对照组,这部分端粒及端粒酶异常的AA患者,发病机制、疾病进展、IST疗效等方面都异于其他患者,临床上可以通过检测PBMNC端粒长度、酶活性及相关突变,预判IST疗效,进而调整治疗方案。端粒及端粒酶可能成为AA治疗的新靶点。