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1背景和目的宫颈癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤之一,在全球恶性肿瘤中占第二位。流行病学研究表明高危型人乳头状瘤病毒(HPV)持续感染是宫颈癌变的重要致病因素,HPV感染是宫颈癌发生的基础,加之其它因素如不良性行为、多产、经济状况低下等共同作用下,最终导致宫颈癌的发生。尽管以上因素在宫颈癌的发病机制中起着非常重要的作用,但具体的致癌作用仍不清楚,缺乏敏感、特异的早期诊断和生物防治指标。从生物学的角度而言,在宫颈癌的发生发展过程中存在多个基因的表达异常。抑癌基因在肿瘤发生过程中发生甲基化以致其蛋白表达失活是肿瘤发生发展的重要机制,进一步了解抑癌基因甲基化有助于了解肿瘤的发生机制。该课题组前期人员已通过采用弱阳离子磁珠芯片(MB-WCX)和基质辅助激光解析附电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术检测了宫颈鳞癌与正常对照组患者血清中蛋白质组的变化特征和规律,建立了诊断宫颈鳞癌的蛋白质组分类模型,筛选出了可能与宫颈癌变有密切关系的候选蛋白；很显然,在分析宫颈鳞癌患者蛋白质组变化的基础上,结合免疫组化和甲基化技术进一步分析这些蛋白在宫颈癌变组织中的变化规律,将能更全面了解这些特异蛋白和基因在宫颈癌患者血清和组织中的影响作用。因此该研究选取在宫颈鳞癌和正常对照组患者血清中蛋白质峰有明显差异的一种叫做腺瘤性结肠息肉易感基因(adenomatous polyosis coil,APC)的抑癌基因,进一步在宫颈鳞癌组织中用免疫组化及基因甲基化方法进行验证分析,探讨APC的表达与宫颈鳞癌发生发展的关系,进而为加深对宫颈癌分子机制的研究,寻找敏感、特异的宫颈鳞癌早期诊断和生物防治的指标和方法提供重要信息。2材料与方法2.1材料宫颈癌标本取自2008年10月至2009年12月于郑州大学第一附属医院妇产科手术切除或活检的新鲜标本,所有组织均经病理学检查证实,病理类型均为宫颈鳞状上皮细胞癌,共60例,伴淋巴结转移者13例。按照FIGO(2000)临床分期：Ⅰ期27例、Ⅱ期24例、Ⅲ/Ⅳ期9例；组织学分级(WHO):G1-G2:39例,G3：21例；患者年龄25-65岁,中位年龄45岁。取同期因子宫肌瘤行子宫全切术的正常宫颈上皮组织15例做对照(宫颈外观光滑,术前TCT检查正常或为炎症)。所有患者术前未经任何治疗,术后病理资料完整。2.2组织处理新鲜组织离体后分为两份,一份作免疫组织化学染色,放入甲醛中固定,常规石蜡包埋。另一份作甲基化特异性PCR (methylation-Specific PCR, MSP),放入液氮内速冻,然后转入-80℃冰箱贮存待用。2.3方法本研究应用免疫组化ABC法检测APC蛋白表达情况；应用MSP法检测APC基因启动子区甲基化发生情况,并将它们与临床资料相结合进行整理分析。2.4统计学处理采用SPSS16.0统计软件对所得数据进行分析,各组间的比较采用连续性校正的x2检验和未校正的Pearson卡方检验或Fisher确切概率法,相关性分析采用Spearman秩相关分析,以α=0.05为检验水准。3结果3.1 APC蛋白的表达3.1.1 APC蛋白在宫颈鳞癌及正常宫颈组织中的表达宫颈鳞癌中APC蛋白阴性表达53例(88.33%,53/60),正常宫颈上皮组织阴性表达1例(6.67%,1/15)。两组差异具有统计学意义(x 235.751,P=0.000)。3.1.2 APC蛋白表达与患者临床病理因素的关系APC蛋白随着宫颈鳞癌组织的临床分期增加,其表达阴性率升高,分别为81.48%、91.67%、100%；组织分化G1-G2和G3其表达阴性率分别为89.74%、85.71%；有淋巴结转移组高于无淋巴结转移组(92.31%vs.84.21%),以上差异均无显著性(P值分别为0.167、0.966、0.791)。3.2 APC基因启动子区的甲基化3.2.1宫颈鳞癌及正常宫颈组织中APC基因的甲基化情况15例正常宫颈上皮标本中均未检测到APC基因启动子区的甲基化扩增条带,60例宫颈鳞癌组织的APC基因启动子区的甲基化率为65%(39/60),两组甲基化阳性率的差异具有统计学意义(x 2=20.312,P=0.000)。3.2.2 APC基因甲基化与患者临床病理因素的关系宫颈鳞癌临床Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ/Ⅳ样本组织中,APC基因启动子区甲基化阳性率分别为74.07%(20/27)、45.83%(11/24)和88.89%(8/9),三组甲基化阳性率的差异具有统计学意义(P=0.025)。组织分化G1-G2和G3甲基化阳性率分别为58.97%(23/39)、76.19%(16/21),两者差异无统计学意义(P=0.182)。APC基因启动子区甲基化阳性率在有无淋巴结转移两组中分别为53.85%(7/13)和34.21%(13/38),两组甲基化阳性率差异无统计学意义(P=0.211)。3.3宫颈鳞癌组织中APC蛋白表达与基因甲基化的相关性甲基化阳性和甲基化阴性的宫颈鳞癌标本中,APC蛋白降低或缺失率分别为97.44%(38/39)、71.43%(15/21),差异具有显著性(P=0.000)。对两组资料进行关联性分析,显示APC基因启动子区甲基化与APC蛋白表达之间呈负相关(r=-0.38,P=0.000)。4结论4.1 APC基因启动子区甲基化可能是宫颈鳞癌发生中的重要分子事件,在宫颈鳞癌发生发展中起重要作用。4.2 APC基因启动子区甲基化是宫颈鳞癌发生过程中的频发事件。4.3 APC基因启动子甲基化异常可能是导致其转录抑制蛋白异常表达的重要原因之一。宫颈鳞癌中APC基因启动子高甲基化导致APC蛋白的失表达可能是宫颈癌变的机制之一4.4 APC基因可能发挥抑癌基因功能,随着宫颈鳞癌的发展在外来因素的作用下甲基化致其表达下降而致癌。