研究背景时至今日,肝脏切除术仍然是肝胆外科医生面临肝肿瘤病人时首先考虑的治疗方法,随着相关的外科理念与外科技术的发展与提高,更多的病人有机会接受肝脏切除来治愈疾病。然而,肝切除相关的各种并发症一直伴随着肝脏外科。正如一位教授在回顾肝脏肿瘤外科发展历程时所言：“肝脏肿瘤外科一路走来,洒满了病人的血、亲人的泪和医生的汗水”。其中,由于剩余肝体积不足而引发的肝功能衰竭则是肝切除术后一种致命的并发症,令人欣慰的是肝脏本身特有的再生能力为这一难题的解决提供了出路,而寻找有效的方法来增加肝切除术后剩余肝脏体积,则成为了肝脏外科医生和相关领域重点关注和致力解决的问题。门静脉栓塞术(portal vein embolization, PVE)和门静脉结扎术(portal vein ligation, PVL)能够促进预留肝再生并已在临床中被广泛的接受和应用,然而,其不足和弊端也为大家所关注,文献报道在PVE/PVL术后等待增生时间较长,预留肝叶增生差异较大,部分病人在等待期间肿瘤进展。肝脏外科医生并未停止探索的脚步,继续努力寻求更有效的提高肝脏再生的手段。2012年"Associating Liver Partition and Portal vein ligation for Staged hepatectomy, ALPPS’技术正式被提出,其方法是术中将拟切除侧门静脉结扎,再联合肝脏实质离断(术中将拟切除侧和预留侧肝叶延缺血断面离断),保留所有的动脉、胆管及肝静脉回流不变,从而在预留肝叶充分增生以后,再进行二次手术切除肿瘤侧肝脏。结果显示其短期内预留肝叶再生迅速。ALPPS的出现迅速吸引了肝胆外科界的目光,成为了研究和讨论的焦点,世界范围内多个医学中心都尝试并开展此项技术。而其相关的再生机制与手术风险等问题都需要进一步研究。临床外科医生在交流展开激烈讨论的同时,也就把目光转向了基础研究领域。本实验中首先建立了大鼠ALPPS术中的门脉结扎联合肝实质离断的动物模型,并尝试从血流动力学、肝脏功能、病理形态学和分子生物学几个方面了解其促进肝再生的机制。并进一步设想是否不同程度的肝实质离断会引起不同程度的肝再生,或者是否有存在一个点只需要离断肝实质到一定程度就可以起到充分再生的作用,这样可以减少手术操作的时间,甚至是否可以减少创伤并进一步能降低手术风险,引申到临床应用中,部分病人由于进行完全肝实质离断比较困难,而且明显延长手术时间,如果仅作部分肝实质的离断就已够用的话,这一类病人是可以获益的。本实验是在这一假设的背景下进行大鼠的相关实验研究,以期为临床应用提供思路和依据。第一部分大鼠选择性门脉结扎联合肝实质离断模型的建立目的：建立一种可重复的稳定的大鼠门脉结扎联合肝实质离断的模型,为进一步研究奠定基础。方法：选取雄性健康SD大鼠,体重250-280g。应用乙醚诱导麻醉后通过小动物麻醉机持续异氟烷吸入麻醉,在手术显微镜的辅助下,首先进行肝周韧带的离断与相应肝叶的游离,分别打开相应的门静脉鞘,结扎或缝扎大鼠门脉右叶支、尾叶支、左支(左外叶与左中叶门脉支),保留大鼠右中叶门脉支,保留所有的胆管与动脉支。门脉右支与尾叶支结扎后相应肝叶会出现缺血,而门脉左支结扎后左外叶和左中叶会缺血变暗,右中叶会充血,并且在肝左中叶与右中叶之间出现一条明显的缺血带,其位于镰状韧带稍右侧2mm左右。在此基础上,应用显微外科技术下结扎或缝扎的办法沿缺血带进行肝实质离断,将左中叶与右中叶分开,断面妥善止血处理。检查腹腔内无异常后温生理盐水冲洗腹腔,丝线连续缝合关腹结束手术。整个模型建立学习及熟练过程分两个阶段进行,第Ⅰ阶段20只大鼠,第Ⅱ阶段10只大鼠。通过比较两阶段的手术时间、手术成功率、并发症率及存活率等,了解学习过程以及模型的可重复性和稳定性。在术后第9天处死所有存活的大鼠及6只正常对照大鼠取出相应肝叶,电子天平称量后评估预留肝叶再生情况。数据采用SPSS18.0软件进行统计分析,以p<0.05为差异有统计学意义。结果；1.手术时间与手术成功率比较：第Ⅱ阶段门脉结扎、肝实质离断与整体手术时间均较第Ⅰ阶段明显缩短(p<0.05)。第Ⅰ阶段20只大鼠手术过程中7只死亡,手术成功率为65%。第Ⅱ阶段手术明显熟悉,成功率为100%,较前一阶段明显提高(p<0.05)。2.手术并发症率与术后存活率比较：在第Ⅰ阶段学习过程中,手术的20只大鼠当中9例出现了出血、胆漏、腹水等并发症。在第Ⅱ阶段手术的10只大鼠中只有1例出现并发症,较前一阶段明显降低(p<0.05)。第Ⅰ阶段20只大鼠除术中死亡7只,剩余13只共死亡5只,术后3天内死亡3只,7天内死亡2只,术后存活率为61.54%,经过第Ⅰ阶段的技能训练及经验积累,第Ⅱ阶段10只大鼠术后存活率为100%,明显高于于第Ⅰ阶段(p<0.05)。3.术后第9天处死所有大鼠,肝右中叶重量为5.72±0.86,约为同体重大鼠的2倍,提示其明显增生。结论：1.在充分了解大鼠肝叶解剖及各肝叶门脉血管的特点后,本部分实验中建立了稳定的可重复的大鼠门脉结扎联合肝实质离断的模型,为进一步的研究提供保障。2.该动物模型对显微外科操作技术要求较高,肝实质离断是本模型的技术难点,实验前的学习阶段是必要和有利的。3.手术技术成熟后,大鼠存活率高,而初步结果显示本模型中大鼠右中叶肝脏再生效果明显。第二部分选择性门脉结扎联合肝实质离断对肝再生的影响及其促进预留肝再生机制的研究目的：对大鼠选择性门脉结扎联合肝实质离断模型术后不同时间点的预留肝叶再生情况进行评价,并通过与单纯选择性门脉结扎和单纯肝实质离断进行比较,并尝试从门静脉血流动力学、组织形态学、病理学及分子生物学等多方面了解其促进预留肝脏再生的可能机制。方法：实验动物同第一部分。依据不同手术处理方式将SD大鼠随机分为4组。第1组,假手术组(SHAM):开腹后游离大鼠各肝叶肝周韧带,游离各肝叶拟结扎处的门静脉,并使之与伴行的肝动脉与肝胆管之间有较充分的空隙。第2组,单纯肝实质离断组(LPT)：在完成上述1组步骤的基础上,使用小血管夹临时夹闭门静脉左支,当出现左中叶与右中叶的缺血线并标记后,松开血管夹,仅行单纯的肝实质离断。第3组,选择性门脉结扎组(SPVL):在第1组步骤的基础上,分别将大鼠的右叶、尾叶支结扎,门脉左支结扎而保留右中叶支门脉血流通畅。第4组,选择性门脉结扎+肝实质离断组(SPVL+LPT):为第2组与第3组步骤的整合,即在选择性门脉结扎的基础上将左中叶与右中叶间肝脏实质离断开。应用血流超声探头测量门静脉主干血流量的变化,应用激光散斑成像仪检测肝右中叶和左中叶微循环血流的变化。术后分别于5个时间点(12h,24h,48h,72h,7d)处死大鼠留取血清和肝组织标本,每个时间点6只大鼠。电子天平称量留取各肝叶重量以计算肝脏再生率。化验检测血清中肝功指标包括ALT、AST、ALB和TBIL的值。HE染色光学显微镜下观察相应肝叶病理学改变。免疫组化方法检测肝右中叶增殖指标Ki-67的表达。以RT-PCR和ELISA方法检测增生肝叶内或血清中细胞因子TNF-a、IL-6、HGF的表达情况。实验数据统计处理同第一部分。结果：1.术后肝再生：各组在术后12h肝再生差别无统计学意义(p>0.05),24h及以后SPVL组与SPVL+LPT组在各时间点均显著高于SHAM组和LPT组(p<0.05)。在术后12h/24h、48h三个时点上SPVL+LPT组的肝再生率与SPVL组差异不显著(p>0.05),而在72h、7d时点上SPVL+LPT组的肝再生率则明显高于S PVL组(p<0.05)。2.免疫组化结果显示：肝右中叶Ki-67表达在术后24h、48h、72h中SPVL与SPVL+LPT组均高于LPT组(p<0.05),而术后48h、72h中SPVL+LPT组Ki-67表达值则明显高于SPVL组(p<0.05)。3.术中测量门静脉血流量的变化显示：LPT组与SHA M组门脉血流量较术前无明显变化(p>0.05), SPVL组与SPVL+LPT组门脉血流量低于LPT组与SHAM组(p<0.05)。而SPVL组与S PVL+LPT组门脉血流量比较无差异(p>0.05)。SPVL术后肝右中叶单位肝组织的门脉血流量较前明显增加(p<0.05)。4.术中激光散斑成像显示：完成选择性门脉结扎步骤后,肝右中叶微循环血量明显增加,而左中叶明显减少(p<0.05)。实施肝实质离断后,肝右中叶微循环血流与之前比较变化不大(p>0.05),而左中叶微循环血流则会较前进一步降低(p<0.05)。5.HE染色显示：术后24h肝左中叶坏死面积SPVL+LPT组较SPVL组大(p<0.05)。6.血液肝功检测：LPT组在术后12h、24h ALT与AST较SHAM组升高(p<0.05)。在术后12h、24h、48h, SPVL组与SPVL+LPT组血ALT与AST水平均较SHAM组和LPT组高(p<0.05)。术后12h、24h, SPVL+LPT组血ALT与AST水平较SPVL组高(p<0.05),术后48h无明显差别。血ALB水平SPVL组与SPVL+LPT组在24h后均较SHAM组和LPT组低(p<0.05),SPVL+LPT组在术后24h、48h较SPVL组低(p<0.05)。血TBIL水平各组各时间点均未见明显差别(p>0.05)。7.术后24h增生肝叶内与血清中细胞因子检测：LPT组、SPVL组与SPVL+LPT组各细胞因子TNF-a、IL-6、HGF水平均表现为上调,而SPVL组与SPVL+LPT组高于LPT组和SHAM组(p<0.01),其中TNF-a、IL-6 mRNA表达水平SPVL+LPT组较SPVL组更高(p<0.01), HGF水平两组无明显差异(p>0.05)。ELISA检测肝匀浆液结果表明TNF-a、IL-6、HGF蛋白水平在SPVL+LPT、SPVL两组与LPT组和SHAM比较明显升高(p<0.01)。其中SPVL+LPT组TNF-a、IL-6的水平均比SPVL组更高(p<0.01),而两组肝组织与血清HGF水平则未见明显差异。结论：1.LPT组并不能促进明显肝再生,同SHAM组和LPT组比较,SPV L与SPVL+LPT都能够有效促进预留肝脏再生,但SPVL+LPT组术后肝再生率提高更为显著。2.门脉血流变化及肝组织血流灌注的变化是肝脏再生的基础条件,在此基础上的肝实质离断则可以更强烈的刺激肝脏再生。3.SPVL+LPT促进预留肝再生与肝实质离断引起的肝左中叶微循环血流进一步减少有关,同时可能与相关的细胞因子TNF-α和IL-6的表达上调有关。第三部分 选择性门脉结扎联合不同程度的肝实质离断对预留肝再生的影响及潜在临床意义目的：通过对大鼠进行选择性门静脉结扎联合不同程度的部分肝实质离断,结合第二部分中SPVL (也即SPVL+0%LPT)和SPVL+LPT(也即SPVL+100%LPT)进行比较,对比与评价不同程度肝实质离断对肝再生的影响,探讨其潜在的临床应用价值。方法：一、首先对大鼠肝实质离断面进行观察测量,确定不同程度的肝实质离断组,通过预实验观察其对预留肝脏再生的影响并进行初步评价。根据肝离断程度不同设立三个实验组：(1)选择性门静脉结扎+25%LPT组(SPVL+25%LPT):结扎大鼠门静脉尾叶支、右叶支、左支同前,肝实质离断为25%。(2)选择性门静脉结扎+50%LPT组(SPVL+50%LPT):即在上述选择性门静脉结扎基础上联合50%的肝实质离断。(3)选择性门静脉结扎+75%LPT组(SPVL+75%LPT):即在上述选择性门静脉结扎基础上联合75%的肝实质离断。每个实验组6只大鼠。术后7d处死大鼠,对各组大鼠术后右中叶肝再生率进行初步评价。根据上述结果,将50%LPT组再加做10只大鼠。二、根据预实验初步结果,结合第二部分选择SPVL组、SPVL+25%LPT组和SPVL+75%LPT组、SPVL+100%LPT组做进一步实验比较。各组手术操作方法同前。术后仍选取5个时间点(12h、24h、48h、72h、7d)处死大鼠取标本,每组每个时间点6只大鼠。术中用激光散斑仪检测不同程度肝实质离断后的肝左中叶微循环血流变化。计算各组各时间点肝再生率。检测血清中肝生化指标ALT、AST、ALB、TBIL值。免疫组化方法检测计算增生肝叶Ki-67的表达情况。以RT-PCR和ELISA方法检测增生肝叶内或血清中细胞因子TNF-a、IL-6的表达情况。实验数据统计处理同第二部分。结果：一、预实验结果与进一步实验分组：SPVL+25%LPT组与单纯SPVL(也即SPVL+O%LPT)肝再生率(HRR)差异无统计学意义,SPVL+75%LPT组与SPVL+LPT (也即SPVL+100%LPT)的肝再生率(HRR)差异无统计学意义,而SPVL+50%LPT组与SPVL+25%LPT组及SPVL组总体无差异,我们考虑是否样本量少而在此基础上又加做10只大鼠,结果仍与上述类似,并且其组内本身差别大,考虑大鼠肝脏断面较小而无法进一步更精细分组使其显出差异,故未将50%LPT组纳入进一步研究。二、SPVL+25%LP T组、SPVL+75%LPT组与SPVL、SPVL+100%LPT组分别比较的结果。实验结果：1.术后12h、24h、48h各组HRR未见差异(p>0.05)。术后72h、7d,SPVL+75%LPT组和SPVL+100%LPT则显著高于SPVL+25%LPT组与SPVL组(p<0.05)。SPVL+75%LPT组和SPVL+100%LPT组HRR各时间点比较无统计学差异(p>0.05)。2.完成门静脉左支结扎血流稳定后,各组不同程度LPT后激光散斑检测右中叶微循环血流变化无明显差异(p>0.05)。左中叶循环血流SPVL+25%LPT组与SPVL组相近,SPVL+75%LPT组与SPVL+100%LPT组均比SPVL+25%LPT组减少(p<0.05). SPVL+75%LPT组与SPVL+100%LPT组则未见统计学差异(p>0.05)。3.术后12h、24h, SPVL+75%LPT组和SPVL+100%LPT组ALT与AST水平显著高于SPVL+25%LPT组与PVL组(p<0.05),而术后12h、24h,SPVL+75%LPT组ALT、AST水平低于SPVL+100%LPT组(p<0.05)。术后24h、48h, SPVL+75%LPT组和SPVL+100%LPT组ALB水平低于SPVL+25%LPT组与SPVL组(p<0.05),四组血TBIL水平差别无统计学意义。4.肝左中叶的坏死面积在SPVL和SPVL+25%组无明显差异(p>0.05)。SPVL+75%LPT组和SPVL+100%LPT则显著高于SPVL+25%LPT组与SPVL组(p<0.05)。SPVL+75%LPT组和SPVL+100%LPT组坏死面积比较则无统计学差异(p>0.05)。 各组增生肝叶中Ki-67表达在术后12h、24h、7d无明显差别。术后48h,72h, SPVL+75%LPT组和SPVL+100%LPT则显著高于SPVL+25%LPT组与SPVL组(p<0.05)。SPVL+75%LPT组和SPVL+100%LPT组Ki-67各时间点比较无统计学差异(p>0.05)。5.增生肝叶中SPVL+75%LPT组和SPVL+100%LPT组TNF-α、IL-6 mRNA水平和蛋白表达显著高于SPVL+25%LPT组与SPVL组(p<0.05),而SPVL+75%LPT组的TNF-a的水平则低于SPVL+100%LPT组,SPVL+75%LPT组和SPVL+100%LPT组IL-6差别尚无统计学意义。而在血清中SPVL+75%LPT组和SPVL+100%LPT组TNF-α、IL-6蛋白水平同样显著高于SPVL+25%LPT组与SPVL组(p<0.05),同时SPVL+75%LPT组的TNF-α、IL-6的蛋白水平则均低于SPVL+100%LPT组(p<0.05)。结论：1.SPVL+25%LPT刺激肝再生的效果与单纯的SPVL相近,而SPVL+75%LPT刺激肝再生明显高于SPVL+25%LPT组。2. SPVL+75%LPT可以达到与SPVL+100%LPT相近的肝再生的效果,并且从肝功能及炎症水平来看,75%LPT有避免更严重肝功能损害及更强烈急性期炎症反应的作用,同时本身缩短了手术时间。对于临床中因肿瘤位置、大小或血管及病人状况等原因而进行完全肝实质离断困难时,可考虑选择性门脉结扎联合部分肝实质离断术来达到既能满足肝再生需求,又能减少首次手术时间、降低出血量、减轻炎症与创伤的目的。