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植物microRNA是一类长度约21-24 nt的内源、非编码小RNA,介导靶标mRNA的剪切或翻译抑制,参与植物的生长发育、代谢调控和逆境胁迫过程。AtmiR399是第一个被证实参与低磷胁迫响应的小RNA。AtmiR399受低磷诱导上调表达,其靶基因AtPHO2下调表达,释放出磷转运蛋白PHO1和PHT1s,促进磷酸盐的吸收和转运。我们通过miRNA靶基因预测软件及查阅相关文献发现:ZmmiR399的预测靶基因主要包括ZmPHTs,暗示ZmmiR399在玉米适应磷胁迫中的分子机制可能不同于拟南芥和水稻,因此本课题拟从ZmmiR399对低磷胁迫的响应入手,探究ZmmiR399在玉米适应低磷胁迫中的分子机制。主要实验结果如下:1、ZmmiR399及其靶基因受低磷诱导:B73经低磷处理后ZmmiR399在根部和地上部均上调表达。5个候选靶基因中ZmPHT1;1/ZmPHT1;3/Zm PHT1;7/ZmPHT1;13在根部和地上部均上调表达,而Zm PHT1;8在地上部上调表达,在根部下调表达。通过检测候选靶基因在Ubi::ZmMIR399b转基因玉米中的表达情况、5′-RACE实验及烟草瞬时表达实验证实了ZmPHT1;3和ZmPHT1;8是ZmmiR399的真实靶基因。2、Ubi::ZmMIR399b转基因玉米成熟叶片出现磷中毒表型:正常磷水培时,Ubi::ZmMIR399b转基因玉米成熟叶片叶尖枯黄坏死,测定成熟叶片中磷浓度发现转基因玉米中磷浓度极显著高于WT,而根部磷浓度比WT减少;低磷水培时磷中毒表型消失,但地上部磷浓度略高于WT,根部磷浓度略低于WT,表明ZmMIR399b过量表达促进了磷的吸收和从根部向地上部的转运。3、ZmPHO2是ZmmiR399的靶基因:Ubi::ZmMIR399b转基因玉米中ZmPHO2转录本显著下降。通过5′-RACE实验重新注释了ZmPHO2,在重新注释的Zm PHO2基因的5′-UTR预测到6个ZmmiR399的切割位点,并证实了其中4个切割位点的存在。烟草瞬时表达实验进一步证实ZmPHO2也是ZmmiR399的靶基因。4、ZmPHO2与ZmPHT1;3和ZmPHT1;8互作:烟草亚细胞定位和玉米原生质体实验发现ZmPHT1;3、ZmPHT1;8与ZmPHO2均可在在细胞膜上表达。BiFC实验证实ZmPHO2与ZmPHT1;3和ZmPHT1;8存在物理上互作。5、ZmPHO2可能介导ZmPHT1;3和ZmPHT1;8的降解:将Zm PHO2分别与ZmPHT1;3和ZmPHT1;8在烟草中共表达时,ZmPHT1;3和ZmPHT1;8转录水平没有显著差异,但是ZmPHT1;3和ZmPHT1;8蛋白水平显著下降,暗示了ZmPHO2可能介导了ZmPHT1;3和ZmPHT1;8的降解。6、ZmmiR399和ZmPHO2在低磷敏感材料和低磷耐性材料中差异表达:转录组测序结果显示ZmmiR399在低磷敏感材料31778中的表达量高于耐低磷材料CCM454。对低磷敏感材料31778、FR19、1538、JI419和低磷耐性材料CCM454、XI14、HAI9-21、Q1261进行正常磷和低磷水培。低磷处理条件下所有低磷敏感材料中ZmmiR399的表达量均高于耐低磷材料,并且低磷处理时所有低磷敏感材料中ZmPHO2 mRNA水平高于正常磷处理,而低磷耐性材料中除Q1261外,其余3个低磷耐性材料中ZmPHO2 mRNA低于正常磷处理。暗示了ZmmiR399-ZmPHO2的关系可能与玉米耐受低磷胁迫能力相关。