肝癌(主要是肝细胞癌,hepatocellular carcinoma,HCC)是世界十大恶性肿瘤之一,居恶性肿瘤发病率第六位,其病死率占第三位,在我国HCC居恶性肿瘤死亡率的第二位。手术切除仍为肝癌最有效的疗法,但即使根治性切除,5年内仍有60%～70%的转移复发率。转移复发已成为进一步延长肝癌病人生存期、提高远期疗效的瓶颈问题,也是最终攻克肝癌的关键。因此,筛选肝癌转移相关基因,探明肝癌转移的分子机制,寻找有效的防治手段成为进一步提高肝癌疗效的关键。骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)是一种分泌型的磷酸化糖蛋白,可与整合素和CD44结合,参与肿瘤细胞的信号转导等过程,许多研究显示其参与多种恶性肿瘤的发生和转移。我们前期与美国国立癌症研究所合作,应用cDNA arrays技术在全基因组范围内比较40例不伴与伴有肝内转移的肝癌之间、肝内转移灶和原发瘤之间基因表达谱的变化,经细胞及组织表达水平分析,证实OPN表达升高与肝癌转移密切相关,应用OPN抗体阻断其作用可抑制肝癌细胞的侵袭转移。后期研究我们还发现肝癌患者外周血OPN表达水平与术后肿瘤转移复发及病人的预后有关,提示OPN可作为肝癌复发转移的预测指标和治疗靶点,具有重要的临床应用价值。本研究拟在前期工作基础上,构建并筛选稳定的OPN不同剪切体过表达肝癌细胞株,通过体内、体外实验观察OPN过表达对肝癌细胞生物学行为的影响;并对OPN基因的启动子SNP位点进行检测和单体型构建,研究OPN基因的SNP、单体型与肝癌转移复发及预后的关系,同时探讨OPN不同剪切体及单体型影响肝癌转移复发及预后的相关机制。第一部分骨桥接蛋白不同剪切体对肝癌细胞生物学行为的影响一、OPN不同剪切体在HCC中表达研究目的:检测HCC中存在的OPN剪切体形式及表达水平差异,探讨OPN不同剪切体与HCC的关系。方法:(1)提取HCC组织RNA。(2)针对OPN及不同剪切体设计特异性引物,利用绝对定量PCR(quantitive Real-time PCR,qRT-PCR)检测HCC中存在的OPN剪切体的形式及表达水平。结果:与癌旁组织相比,癌组织和转移灶中总OPN量表达明显升高,而且在HCC中同时表达OPN三种剪切体(OPN-1、OPN-2、OPN-3),其中OPN-1(全长)和OPN-2(缺少外显子5)表达量显著高于OPN-3(缺少外显子4),均达到统计意义(P＜0.01)。结论:在HCC中,同时表达OPN三种剪切体形式,且OPN不同剪切体表达存在差异。二、OPN三种剪切体对肝癌细胞生物学的影响(一)载体构建、转染和稳定细胞株的筛选目的:构建、筛选获得三种特异性表达GFP-不同剪切体融合蛋白稳定转染细胞株。方法:构建OPN三种不同剪切体表达载体,并将其和对照空质粒分别转染人无转移潜能肝癌细胞株Hep G2,利用G418筛选获得稳定转染细胞株。结果:经测序证实OPN三种不同剪切体表达载体插入的序列完全正确,Western blot及荧光检测表明经筛选的细胞株分别稳定表达GFP及OPN三种剪切体。结论:我们成功构建并筛选出特异性表达OPN三种不同剪切体及对照质粒稳定转染细胞株。(二)OPN对肝癌细胞体外增殖和侵袭转移的影响目的:观察OPN三种剪切体对HepG2细胞粘附、运动、侵袭、细胞周期的影响,并探讨OPN及三种剪切体对MMP2、uPA等与HCC转移侵袭密切相关的因子变化及肿瘤相关信号通路的影响。方法:采用CyQUANT细胞增殖试剂盒、Matrigel胶、流式细胞仪比较了OPN三种剪切体过表达后肝癌细胞Hep G2的体外粘附、运动能力、侵袭能力及细胞周期的变化,利用Werstern blot、Elisa实验检测人重组OPN蛋白及三种剪切体对MMP2、uPA等与HCC转移侵袭密切相关的因子变化及肿瘤相关信号通路的影响。结果:(1)OPN三种剪切体过表达对HepG2细胞体外粘附、运动、侵袭及细胞周期的影响OPN-1、OPN-2、OPN-3三种剪切体重组质粒及对照转染HepG2细胞后,细胞粘附实验结果显示,与空白质粒(Mock)相比,OPN-2组细胞粘附能力显著增加(P＜0.01),而OPN-1、OPN3组细胞粘附能力无统计学意义(P＞0.05)。Matrigel侵袭实验发现,转染OPN-1、OPN-2、OPN-3三组重组质粒Hep G2细胞穿过人工基底膜的细胞数分别为:22.3±2.1、8.4±1.7、28.5±3.8个,与质粒对照组(7.5±1.5)相比,OPN-2没有变化,而OPN-1、OPN-3两组细胞穿过人工基底膜的细胞数显著增加(P＜0.05)。而这三种剪切体对细胞运动和细胞周期均无统计学影响。(2)OPN三种剪切体过表达对细胞分泌MMP2及肿瘤相关信号通路的影响OPN三种剪切体重组质粒及空质粒的稳定转染HepG2细胞株(OPN-1、OPN-2、OPN-3、GFP)5×10~5接种6孔板,细胞贴壁后换无血清培养基继续培养。20hr后Elisa实验分析细胞培养上清,发现MMP-2表达量显著性增加(P＜0.05)。Western blot检测了OPN三种剪切体过表达后,转移侵袭相关因子MMP-2、uPA的表达情况及对肿瘤相关信号通路的影响,结果显示OPN-3可能通过AKT磷酸化信号通路,OPN-1和OPN-2可能激活STAT3-Survivin信号通路,诱导MMP-2和uPA表达(P＜0.05)。(3)外源人重组OPN蛋白对肝癌细胞增殖及肿瘤相关信号通路的影响不同浓度重组人OPN蛋白刺激HepG2细胞,分别在12hr、24hr、48hr检测细胞增殖能力,当重组人OPN蛋白浓度小于2.0μg/ml时,细胞增殖数在24小时以内达到最大值,随后随着时间的延长细胞增殖能力下降。但当外源人重组OPN蛋白达到5.0μg/ml时,细胞增殖数具有时间依赖性(P＜0.01)。10μM重组人OPN蛋白刺激HCCLM3细胞,分别在0min、45min、70min和2h抽提HCCLM3胞浆和胞核蛋白,检测p65蛋白的表达,结果显示OPN蛋白作用2小时后,胞浆内p65蛋白表达明显少,而胞核内表达增加(P＜0.001)。为进一步研究OPN与MMP2、uPA的关系及对肿瘤相关信号通路的影响,HCCLM3细胞无血清培养24小时后分别用P65蛋白活化抑制剂PDTC(50μM)和AKT磷酸化抑制剂LY294002(10μM)处理30min后加入10μg/m OPN,Western blot结果显示OPN能上调MMP2和uPA的表达,诱导p65蛋白从胞浆逐渐转移至胞核,激活AKT磷酸化信号通路,并且激活作用可以被PDTC和LY294002抑制。结论:(1)OPN三个剪切体在HCC中起着不同的作用,其中OPN-2显著增加细胞的粘附能力,而OPN-3显著提高细胞的侵袭能力,但三个剪切体对细胞运动、细胞周期均没有统计学影响。OPN不同剪切体在HCC中发挥不同功能可能与其激活不同的信号有关,OPN-1、OPN-2激活STAT3-Survivin信号通路,OPN-3激活AKT磷酸化,从而导致细胞内MMP-2和uPA的表达增加。(2)外源人重组OPN对肝癌细胞的增殖与时间、浓度密切相关。OPN促进肝癌细胞的增殖可能通过NF-κB、AKT信号通路调节MMP-2和uPA的表达。(三)OPN三种剪切体对肝癌细胞成瘤和转移的影响目的:通过裸鼠人肝癌模型进一步验证OPN三种剪切体过表达对肝癌细胞Hep G2生物学行为的影响。方法:Mock(空质粒)、OPN-1、OPN-2、OPN-3四组Hep G2细胞(1×10~7/只)裸鼠皮下接种,每周两次观察裸鼠的成瘤和转移情况;裸鼠皮下接种七周后,处死裸鼠,取肝、肺组织活体冷光荧光影像分析仪观察肝肺转移灶。结果:与Mock对照组(Mock组1533.1±537.9 mm~3)相比,OPN-1、OPN-3组裸鼠肿瘤体积明显增加(第七周OPN-1组为3820.4±895.5mm~3,OPN-3组为4189.3±916.3mm~3),差异显著(P＜0.01);而OPN-2组为1687.9±589mm~3,无显著差异(P＞0.05)。活体冷光荧光影像分析仪观察四组裸鼠皮下瘤,可见明显的发光瘤体,然而肝、肺转移灶的荧光却无法探测到,这可能与GFP蛋白穿透力比较低有关。裸鼠皮下接种七周后,取肝肺组织活体冷光荧光影像分析仪观察,OPN-1、OPN-3组裸鼠可见明显的肝内转移灶,而OPN-2和对照均无肝内转移灶。结论:体内与体外的实验结果基本一致,进一步说明OPN三种剪切体过表达对HepG2细胞生物学行为影响是不同的,OPN-1、OPN-3促进肝癌细胞侵袭转移,其中,OPN-3作用更为显著。第二部分骨桥蛋白启动子多态性与肝癌预后的关系一、OPN基因启动子基因型、单体型与肝癌转移复发关系及其机制探讨(一)OPN基因启动子SNP检测、单体型构建及其与肝癌转移复发的关系目的:探讨OPN基因启动子基因型、单体型与肝癌转移复发的关系。方法:从HCC手术样本中提取基因组DNA,随机选取30例HCC对OPN基因启动子区域2.3kb进行测序,发现SNP位点后,筛选510例临床样本,根据临床资料将样本分为未转移复发组(Group 1)和转移复发组(Group 2),应用焦磷酸测序方法检测510例样本OPN基因启动子SNP,构建单体型,分析基因型、单体型与肝癌转移复发的关系。结果:在2.3 Kb测序区域中,共发现4个SNP位点[-1748A/G、-616G/T、-443C/T、-156G/-(-表示该位点G等位基因缺失)]和一个新的插入碱基-1263A/A。单体型构建后发现共存在14种单体型,其中GTTG,AGT-,AGC-(依次为4个SNP的等位基因:-1748 A/G、-616G/T、-443C/T、-156G/-,后同)三种单体型占91.06%。3个SNP(-1748A/G、-616G/T、-156G/-)表现为强连锁不平衡关系(r~2=0.74-0.8),而-443C/T出现重组现象,与上述3个SNP连锁较弱(r~2=0.22-0.25);临床病理特征分析提示SNP-443C/C基因型病人不易转移复发(CC:OR=0.49,95%CI 0.26-0.94,P＜0.05),是HCC转移复发的保护性因子。而其他三个SNP位点-1748 A/G、-616G/T、-156G/-与HCC转移复发无显著性相关(-1748 A/G,AG:OR=0.75,95%CI0.46-1.22,GG:OR=0.72,95%CI 0.41-1.25;-616G/T,GT:OR=0.76,95%CI0.47-1.24,TT:OR=0.97,95%CI 0.56-1.68;-156G/-,G-:OR=0.78,95%CI0.48-1.27;GG:OR=0.79,95%CI 0.46-1.37,P＞0.05)。通过单体型构建发现,单体型AGC-主要存在于非转移复发组中,单体型AGT-主要存在于转移复发组中,且与转移复发正相关(OR=1.44,95%CI 1.04-2.01,P=0.03)。结论:肿瘤转移相关基因OPN SNP-443C/C基因型与HCC转移复发呈负相关,是HCC转移复发的保护性因子。单体型AGT-与HCC转移复发呈正相关,是HCC转移复发的危险性因子,针对不同SNP基因型和单体型分析可能会为肝癌转移复发、预后预测提供新的途径和分子遗传学指标。(二)OPN基因启动子SNP基因型和单体型影响肝癌转移复发机制探讨目的:基于上述研究结果,构建OPNAGT-、AGC-的两种单体型启动子双报告表达载体,探讨OPN启动子SNP-443C/T和其相应的单体型AGT-、AGC-对其转录活性的影响及其可能机制。方法:PCR方法扩增含2271bp的从-2261bp至基因内部+10bp的启动子序列,将含有两种单体型(AGT-、AGC-)的启动子序列插入到pGL3质粒,并分别转染不同的肝癌细胞,采用双荧光报告法,检测荧光素酶的活性,重复3次。利用EMSA实验检测Myb蛋白与OPN启动子特异性结合的位点及基因型。结果:两种OPN单体型的启动子都具有显著转录活性(与空pGL3-basic质粒相比),其中AGT-单体型启动子转录活性较AGC-单体型启动子强,差异具有统计意义(P＜0.05)。同时-443T/T探针和-443C/C探针与蛋白复合物迁移率均被Myb蛋白特异性结合的DNA保守序列抑制,而且OPN-443T/T的探针与蛋白复合物迁移率明显下降。结论:OPN启动子SNP-443C/T的不同单体型对基因的转录活性有显著影响,能启动不同水平的基因转录。Myb蛋白特异性结合在OPN SNP-443 C/T处,而且Myb蛋白与T/T基因型亲和力明显高于C/C基因型。二、OPN启动子不同基因型和单体型与预后的关系目的:探讨OPN基因启动子SNPs和单体型与HCC预后的关系。方法:选取2002-2003年手术切除、具有5年完整术后随访资料(包括术后复发及再手术情况等)的311例HCC的石蜡包埋的肿瘤组织样本,提取DNA,应用焦磷酸测序方法对4个SNPs进行检测、单体型构建后,探讨SNPs基因型、单体型与术后生存(Overall Survival,OS)、无瘤生存(Disease Free Survival,DFS)的关系。结果:Kaplan-Meier生存曲线提示:-443C/C的基因型和AGC-(Ht3)纯合子HCC病人术后OS及DFS明显高于TT和TC基因型及非纯合子和其它单体型(P＜0.05);而其它位点SNP基因型与HCC病人之间的术后OS及DFS无统计差异(P＞0.05)。Cox风险比例模型多因素分析发现-443C/C基因型和Ht3纯合子单体型是HCC病人OS(术后不易复发)的保护性因子,可以作为独立的临床预测指标(TC:OR=5.026,95%CI 1.221-22.205,P=0.026,TT:OR=5.748,95%CI 1.350-24.476,P=0.018;Ht3杂合子:OR=6.940,95%CI 0.944-51.040,P=0.051,其他单体型:OR=9.370,95%CI 1.295-67.824,P=0.027)。同时Ht3纯合子单体型还是HCC DFS的独立预测因子(P=0.024)。结论:我们研究表明肿瘤转移相关基因OPN启动子上的SNPs与HCC预后关系密切。-443C/C基因型和Ht3纯合子单体型是HCC术后DFS(术后不易复发)的的保护性因子,可以作为独立的临床预测指标。同时Ht3纯合子单体型是HCC OS的独立预测因子。