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实验背景及目的糖尿病引起的严重动脉粥样硬化已成为其高发病率及致死率的主要原因。糖尿病心肌病作为糖尿病心血管并发症,已公认是最为常见和最严重的糖尿病慢性并发症之一。心肌微血管内皮细胞(cardiac microvascular en-dothelial cells,CMECs)作为其发病的始动环节,具有不同于心脏血管内皮细胞的多种功能特异性,故CMECs的研究对诠释糖尿病心肌微血管病变的发病机制,及研究新的治疗方法和评价新的治疗药物都具有重要的价值。糖尿病是一种慢性免疫炎症反应。既往研究表明,体内长期高糖所致的蛋白质的非酶糖化反应产物,糖基化终产物(advanced glycation end pro-ducts,AGEs)是糖尿病并发症的重要致病因素。它与其特异性受体(receptorfor advanced glycation end products,RAGE)信号转导机制可导致持续的炎性反应。AGEs与RAGE结合,可激活多种细胞信号转导通路,导致大量促炎症因子的释放,诱发血管的炎性损伤。既往AGEs-RAGE作用系统的研究多集中在糖尿病大血管,但目前发现AGEs-RAGE轴效应同样作用于糖尿病微血管病变。故阻断AGEs-RAGE信号系统已公认为是未来治疗糖尿病慢性并发症的重要靶点。羟甲基戊二酰辅酶A(3-hydroxy-3-methylgutaryl coenzyme A,HMG-CoA)还原酶抑制剂他汀(Statins)已证实具有免疫调节及抗动脉硬化功能。近几年不少学者开始关注他汀对糖尿病血管炎性病变的治疗作用。结果发现他汀不仅在临床上明显降低了糖尿病患者心血管事件的发生率,也在细胞水平上发挥了调节和改善内皮功能的作用。最近还发现他汀可调节微血管内皮细胞AGEs-RAGE信号系统,但具体机制不是十分清楚。因此我们假设他汀是否可通过影响CMECs AGEs-RAGE信号系统来发挥抗心肌微血管动脉硬化的作用。本实验在体外培养CMECs的基础上,观察AGEs对CMECs表达单核细胞趋化因子-1(monocyte chemoattracta,nt protein-1,MCP-1)、细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)及RAGE的影响;观察羟甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂辛伐他汀(simvastatin)干预后,对AGEs诱导CMECs表达MCP-1、ICAM-1及RAGE的影响,并进一步探讨其可能机制。为他汀治疗糖尿病心肌微血管病变提供新的实验依据。实验方法第一部分:大鼠CMECs的体外培养、鉴定及AGEs的制备。1.无菌剪取大鼠心脏左心室,去除内、外膜,用酶消化法分离CMECs,并接种于铺有鼠尾胶的培养皿中培养5～7天(d)后消化传代。根据细胞形态,并通过Ⅷ因子的表达、DiI-Ac-LDL的摄取进行鉴定,并计算阳性率。2.将一定量牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)、D-葡萄糖混合均匀,过滤除菌后封口密闭。同时设置无D-葡萄糖的BSA对照组。于37℃孵箱内避光孵育12周,获得棕色产物AGE-BSA。应用透析袋除去未结合蛋白的葡萄糖。根据AGEs特有的荧光特性,用荧光分光光度计,以激发波365nm,发射波长460nm测定其中所含的荧光单位。第二部分:AGEs对CMECs表达MCP-1和ICAM-1的影响及机制。取2代细胞,按实验要求分成若干组,分别加入不同浓度AGEs共培养72小时(h)后,用酶联免疫检测(enzyme-linked immunosorbnent assay,ELISA)法检测MCP-1的表达,流式细胞仪(flow cytometry,FCM)测定ICAM-1的表达,逆转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)法测定RAGEmRNA的表达及Western-blot法检测RAGE蛋白表达。第三部分:Simvastatin对AGEs诱导CMECs表达MCP-1和ICAM-1的影响及机制。取2代细胞,按实验要求分成若干组,先分别加入不同浓度Simvastatin预孵6h,再加AGEs共培养72h后,用ELISA法检测MCP-1的表达,FCM测定ICAM-1的表达,RT-PCR法测定RAGE mRNA的表达及Western-blot法检测RAGE蛋白表达。实验结果1.采用酶消化法成功分离出CMECs,并在培养的第2～3d可形成管样结构,5～7d融合呈典型的“铺路石”样形态。第Ⅷ因子阳性表达率是90.68%,DiI-Ac-LDL摄取阳性率为93.82%。在体外经非酶促反应制备的AGE-BSA经荧光分光光度计鉴定AGEs的含量为218U/mg蛋白,对照组白蛋白AGEs的含量为0.65U/mg蛋白。2.与BSA对照组比较,不同浓度的AGEs可显著增加CMECs MCP-1和ICAM-1的表达(P＜0.05),且在蛋白及mRNA水平均明显增加RAGE的表达(P＜0.05),呈浓度依赖性。3.与单纯AGEs作用组比较,小剂量Simvastatin(0.1μmol/L、1μmol/L)明显抑制AGEs诱导的CMECs表达ICAM-1、MCP-1的增加(P＜0.05),且在蛋白及mRNA水平均明显抑制RAGE的表达(P＜0.05)。结论1.AGEs可刺激CMECs过表达ICAM-1和MCP-1,从而加速心肌微血管炎症的发生。其机制可能是通过AGEs上调CMECs RAGE的表达。也进一步证实了AGEs-RAGE信号系统的起动是糖尿病心肌微血管病变发生发展一个重要原因。2.小剂量Simvastatin可抑制AGEs诱导CMECs表达MCP-1和ICAM-1。其可能机制是通过下调CMECs RAGE的表达,说明Simvastatin可通过调节AGEs-RAGE信号途径来发挥其对糖尿病心肌微血管病变的保护作用。