多发性硬化是一种T细胞免疫介导的自身免疫性疾病,由T细胞分泌的炎症因子执行炎症过程,在临床症状的复发及缓解占据重要作用。疏肝健脾固髓方是临床治疗多发性硬化的经验方,在前期的临床研究中提示有较好的疗效。本研究旨在观察疏肝健脾固髓方对多发性硬化T细胞亚群及其下游炎症因子的影响,并结合网络药理学探讨其治疗多发性硬化的靶点。1.疏肝健脾固髓方对多发性硬化患者T细胞亚群的影响目的：研究疏肝健脾固髓方治疗多发性硬化前后T细胞亚群的改变。方法：利用中医证候调查表将所有多发性硬化患者每次就诊的中医表征进行量化处理,对所有症状的出现频率进行统计,研究多发性硬化的中医证候特点。对所有患者每次就诊时的外周血T细胞亚群通过流式细胞仪进行检测,急性期采用激素冲击治疗,治疗前后分别检测,稳定期采用疏肝健脾固髓方加减治疗,每3个月检测一次。结果：男女患者发病年龄相比较无显著差别(P=0.493,P>0.05),男女患病人数比例约为1：3,各年龄段的性别比例无明显差别(x2.418,p=0.659,P>0.05)。MS患者特有的神经功能缺损症状以肢体麻木最常见,占66.7%；其次为感觉异常和肢体无力,各占60.3%。MS患者中医症状出现频率在50%以上的症状有3项,分别为神疲乏力(65.1%)、腰膝酸软(55.6%)、情绪低落(50.8%)；出现率在40-50%的症状有5项,分别为汗多(47.6%)怕冷(46%)、多梦(46%)、心烦(41.3%)、健忘(41.3%)；出现率在30-40%的症状有6项,分别为少气懒言、咽干口燥、大便干结、大便粘腻、头昏沉、胸闷；舌象中出现最多的是舌体胖大(12.7%)、舌色淡(60.3%)、苔薄(76.2%)；脉象中出现最多的是脉细(52.4%),其次为脉沉(44.4%)多发性硬化患者激素治疗后CD3+CD4-CD8-T细胞与激素治疗前相比降低41%,差异有显著意义(P=0.010,P<0.05)；其余各T细胞亚群均无显著性差异(P>0.05);CD4+/CD8+T细胞比值在激素治疗前后无明显变化(P=0.345,P>0.05)。疏肝健脾固髓方治疗后CD3+CD4-CD8-T细胞与治疗前相比降低12%,差异有显著意义(P=0.000,p<0.05):CD3+CD4+CD8-T细胞绝对值治疗后比治疗前升高5%,但无显著意义(P=0.097,P>0.05)；其余各T细胞亚群均无显著性差异(p>0.05):CD4+/CD8+T细胞比值在治疗前后无明显变化(P=0.206,P>0.05)。结论：(1)各年龄阶段中男女患者人数存在明显差异,女性患者明显多于男性,男女比例约为1：3.2,符合相关文献的研究。(2)临床证候研究中出现频率最高的证候为肾精亏虚,其次为肝郁、脾虚,舌脉的表现也是以虚证为主。说明多发性硬化的证候表现是以肾精亏虚为主,肝郁、脾虚等为辅,为疏肝健脾固髓方治疗多发性硬化提供了证候学依据。(3)激素和疏肝健脾固髓方治疗后CD3+CD4-CD8-T细胞与治疗前相比均显著降低,推测其在MS病程中促进炎症的发生,而激素和疏肝健脾固髓方都能通过在疾病不同阶段显著改善CD3+CD4-CD8-T细胞达到抗炎作用。(4) CD3+CD4+T细胞亚群作为T辅助细胞,代表了免疫应答的激活程度,在疏肝健脾固髓方治疗后CD3+CD4+ T细胞绝对值比治疗前有升高趋势,但无统计学意义。2.疏肝健脾固髓方对EAE炎症因子的影响目的：观察疏肝健脾固髓方对多发性硬化小鼠模型EAE血清炎症因子的影响。方法：通过设立激素对照组、EAE模型组和疏肝健脾固髓方组。观察疏肝健脾固髓方干预EAE后各炎症因子的变化,利用高通量蛋白液相芯片检测不同时间炎症因子的变化,这些因子为：ⅠL-23、IL-17E/IL-25、GM-CSF、IL-12p70、IL-17F、IL-17A、TNF-a、 1FN-γ、IL-4、IL-10,探讨疏肝健脾固髓方对EAE炎症因子的影响。结果：(1)本实验应用MOG35-55多肽片段诱导C57BL/6小鼠制备慢性迁延型动物模型,并观察了其完整的病程变化,并且观察到了复发缓解的现象。(2)正常脑和脊髓组织中未见血管增生和炎症细胞浸润,EAE组脊髓组织切片可见炎症细胞浸润,血管增生并呈袖套样改变等炎症表现,脊髓炎性反应程度明显较大脑严重。激素组和疏肝健脾固髓方组脑和脊髓组织切片可见微血管增生,但疏肝健脾固髓方组微血管增生更为明显,且脑组织神经细胞肿胀、呈空泡状改变。(3)各组炎症因子在不同时间的变化：EAE模型组各时间点之间比较均无显著差异；疏肝健脾固髓方组各时间点之间均无显著差异。激素组TNF-a的表达在4周时与0周时相比显著降低(P=0.030,P<0.05),其余各炎症因子不同时间无显著性差异。(4)在相同时间各组炎症因子的变化：造模前(即0周)各炎症因子在EAE组、激素组、疏肝健脾固髓方组之间,均无显著性差异。在造模后4周TNF-a疏肝健脾固髓方组与激素组相比显著升高(P=0.002,P<0.05)。4周时IFN-y激素组与EAE组相比显著降低(P=0.029,P<0.05)。4周时IFN-y疏肝健脾固髓方组与EAE组相比显著降低(P=0.021,P<0.05),余炎症因子无显著变化。结论：(1)通过对EAE的长期观察,我们选择造模后14天的EAE小鼠作为开始药物治疗的时间点。并确定在4周时检测TNF-α, IFN-γ作为检测较为敏感的时间和指标。(2)提示疏肝健脾固髓方和激素均通过抑制IFN-γ的表达产生抗炎作用。(3)提示激素可能通过降低TNF-α的表达产生抗炎作用。而疏肝健脾固髓方的抗炎机制可能与激素组不同,激素对TNF-α有所降低,而疏肝健脾固髓方对TNF-α有所升高,但它们的影响都较弱(它们与EAE组比较均无差异),提示TNF-α在EAE中的作用可能较为复杂。3.疏肝健脾固髓方治疗多发性硬化的基因靶点研究目的：研究疏肝健脾固髓方治疗多发性硬化疾病的基因靶点。方法：以Multiple sclerosis为疾病名称,在OMIM数据库中查找与之相关的基因：基于疏肝健脾固髓方的药物组成,在TCMSP数据库中寻找相应的靶点,将经DrugBank数据库中验证的靶点予以保留,然后将疾病相关基因及各个药方的靶点分别映射于STRING数据库进行网络构建,采用DAVID软件对各个网络进行功能的富集分析,从KEGG Pathway角度,保留P<0.05的结果进行进一步功能分析。结果：Tnf、Stat3、Vegfa、1117a 和 I12ra具有较高的网络介数和网络度,在多发性硬化相关基因网络中有重要的地位。疏肝健脾固髓方作用靶基因T nf、Vegfa在多发性硬化相关基因中同时具有较高的介数和网络度。结论：疏肝健脾固髓方作用靶基因与多发性硬化相关基因存在重叠,这些重叠基因很可能是上述方药治疗多发硬化的起效点。其中Tnf、Vegfa在多发性硬化相关基因中同时具有较高的介数和网络度,提示这两个靶基因可能是疏肝健脾固髓方治疗多发性硬化的关键位点。