第一部分塞来昔布对COX-2不同表达水平肿瘤细胞的放射增敏作用目的:观察和分析COX-2选择性抑制剂塞来昔布对COX-2不同表达水平肿瘤细胞的增殖抑制和放射增敏作用,以及对不同肿瘤细胞作用不同时间后BCCIP基因表达的情况。方法:选择人肺腺癌细胞A549、宫颈癌细胞He La及结肠癌细胞HCT116进行实验研究。采用CCK-8法测定不同浓度塞来昔布与肿瘤细胞培养不同时间后,对细胞活性的影响;克隆形成实验观察塞来昔布对三种肿瘤细胞放射敏感性的影响;Western blot法观察COX-2基因的蛋白表达;所有实验数据均以means+SD表示,两组间比较采用配对样本t检验。细胞存活曲线用拟和软件Graph Pad软件生成,以线形二次方程及多靶单击模型拟合,反映细胞敏感性的参数D0、Dq、N和K值由软件直接得出。结果:肺腺癌细胞A549和宫颈癌细胞He La都有COX-2的高表达,而结肠癌细胞HCT116的COX-2表达是阴性的;不同浓度和不同作用时间的塞来昔布对三种肿瘤细胞株均具有明显的增殖抑制作用,增殖抑制率(IR)随药物浓度增加及作用时间延长而呈增高趋势,具有剂量和时间依赖性;在0~40μmol/L范围内,塞来昔布对细胞增殖抑制作用无统计学差异,后续实验都采用对细胞增殖无明显影响的塞来昔布浓度进行实验;30μmol/L塞来昔布对三种细胞均有放射增敏效应,SERD0值分别为:A549细胞1.254,Hela细胞1.213,HCT116细胞1.224;三种肿瘤细胞株中均有BCCIP的正常表达,但表达水平略有差异,COX-2表达阴性的HCT116细胞在塞来昔布作用一定时间后,可见BCCIP表达上调。结论:肿瘤细胞中COX-2表达水平并不影响塞来昔布对肿瘤细胞的放射增敏效应,30μmol/L塞来昔布处理COX-2表达阴性的HCT116细胞后6小时,细胞的BCCIP表达明显升高。第二部分sh RNA法构建稳定敲低BCCIP基因的结肠癌细胞目的:构建稳定敲低BCCIP基因的结肠癌细胞并观察塞来昔布对BCCIP不同表达水平的结肠癌细胞放射敏感性的影响。方法:采用BCCIP-sh RNA质粒转染HCT116细胞建立BCCIP敲低细胞模型C12,通过RT-PCR技术检测了HCT116细胞中瞬转质粒后BCCIP转录本表达水平,通过Western blot技术比较正常和稳定敲低BCCIP基因的HCT116细胞中BCCIP蛋白表达的情况,通过克隆形成实验观察塞来昔布对同源但BCCIP表达水平不同的HCT116细胞株的放射增敏效应。结果:转染了p PUR/U6-311+p Silencer2.1Hyg-633和p PUR/U6-311+p Silencer2.1Hyg-730载体组合的HCT116细胞中BCCIP的表达在转录本水平有明显降低,降低程度超过95%(P<0.05)。收集稳定转染后经嘌呤霉素筛选的单克隆C12细胞及对照组细胞总蛋白,采用Western blot法从蛋白表达水平检测BCCIP的表达情况,与未转染组细胞相比,转染p PUR/U6-311+p Silencer2.1Hyg-730的HCT116细胞中BCCIP的表达在蛋白质水平有明显降低。30μmol/L塞来昔布对HCT116细胞有明显的放射增敏效应,增敏比为SERD0=1.224,但在BCCIP低表达的C12细胞中未观察到塞来昔布的放射增敏效应,增敏比SERD0=1.038。结论:BCCIP稳定敲低的HCT116细胞(以下都称为C12细胞)可以被成功构建并长期培养,与BCCIP正常表达的HCT116细胞相比,30μmol/L的塞来昔布对该细胞的放射敏感性没有影响。第三部分BCCIP基因在塞来昔布放射增敏中的作用机制目的:观察BCCIP基因在塞来昔布提高HCT116细胞放射敏感性中的作用,并探讨和研究可能的机制。方法:采用Western blot法观察经30μmol/L塞来昔布处理后用6Gy剂量照射不同BCCIP表达水平的两种细胞,照射后1h、3h和18h,两种细胞γ-H2AX、ATM和Chk2等放射损伤相关蛋白的表达情况;免疫荧光法检测两种细胞接受上述处理后细胞中的γ-H2AX foci形成情况;流式细胞法检测两种细胞未处理组、加30μmol/L塞来昔布组、不同剂量单纯照射组和不同剂量照射+30μmol/L塞来昔布组的细胞周期分布和细胞凋亡的情况;Western blot法对比两种细胞未处理组、30μmol/L塞来昔布组、6Gy单纯照射组和6Gy照射+30μmol/L塞来昔布组细胞内周期相关蛋白的表达情况。结果:HCT116细胞在30μmol/L塞来昔布+6Gy照射处理后1h、3h和18h,细胞中γ-H2AX、ATM、Chk2蛋白表达较单纯放射组和对照组明显升高,但在C12细胞中我们没有观察到这一变化;免疫荧光法也观察到一致的结果;照射前6h联合30μmol/L塞来昔布,可明显增强HCT116细胞由电离辐射诱导的G2-M期阻滞,差异具有统计学意义(P<0.01);但在C12细胞中没有观察到这种差异(P>0.05);无论是HCT116细胞还是C12细胞,放射均能导致细胞发生明显凋亡(P<0.01),HCT116细胞在放射前加入30μmol/L塞来昔布处理后,凋亡率升高(P<0.05),而C12细胞在放射前加入塞来昔布处理后,凋亡率升高不明显(P>0.05);30μmol/L塞来昔布联合放射作用HCT116细胞,BCCIP和p53、p21蛋白表达增加,而Cyclin B1蛋白表达下降,而在C12细胞中,上述蛋白表达均没有变化。结论:BCCIP可能是一种与放射敏感性有关的靶点基因,塞来昔布通过对BCCIP的调控,增加细胞的放射损伤,影响其下游的p53的功能,从而影响p21、Cyclin B1等基因的表达,经由细胞阻滞和凋亡的增加发挥放射增敏的效应。第四部分BCCIP表达水平对预测塞来昔布联合术前放化疗提高直肠癌疗效的意义目的:通过检测治疗前每个病人活检直肠癌组织中的BCCIP、COX-2和p53的表达情况,与塞来昔布口服联合术前放化疗后手术切除标本病理反应的关系,研究各基因表达与疗效之间的相关性,探讨BCCIP的表达水平在预测塞来昔布提高直肠癌术前放疗敏感性的临床意义。方法:选择年龄为18~70岁、PS评分0~2分、治疗前经病理活检确诊为腺癌或腺瘤癌变、治疗前未接受过直肠手术或放化疗的患者,放化疗前活检肿瘤组织进行常规病理切片检查并制作组织芯片;放化疗前、手术前常规各进行一次盆腔MRI检查(因各种原因无法接受MRI检查的病人行增强盆腔CT检查),并由专业影像科医师进行读片并对比治疗前后肿瘤退缩情况;采用免疫组化法对组织芯片进行染色读片,检测BCCIP、COX-2和p53的表达情况;所有患者均接受术前塞来昔布联合放化疗+手术治疗;根据TRG法对切除的肿瘤标本进行放疗敏感性的评估;根据治疗前后盆腔MRI影像上对比肿瘤退缩情况,采用RECIST评分评价临床疗效;对不同疗效评价之间的相关关系采用spearman相关分析;采用Fisher’s确切概率法评价临床信息的差异和蛋白表达与疗效之间的相关性,P<0.05为显著性差异标准。结果:2012年1月至2014年12月期间苏州大学附属第一医院放疗科收治31例符合入组标准的直肠癌患者接受术前塞来昔布联合放化疗,所有患者都完成了塞来昔布联合放化疗的预定治疗,治疗耐受性良好。其中,3例患者因治疗后肿瘤退缩明显,局部症状明显改善而且因为年龄较大或有手术禁忌证而拒绝行手术治疗(临床影像学评价均为CR),后续继续局部放疗加量照射达根治量;31例病人中,有7例病人BCCIP表达阴性,2例病人COX-2表达阴性,4例病人p53表达阳性;术后有5例病人获得了病理学的完全缓解(p CR),p CR率为17.9%(5/28),但全组肿瘤退缩(TGR grade3+4)和影像学客观有效率(CR+PR)分别达到了53%(15/28)和77%(24/31);经单因素分析,BCCIP的表达与治疗后肿瘤的TRG、RECIST客观有效明显相关(P=0.029和0.002),但与p CR的相关性不强(P=0.290),COX-2的表达与疗效无关(P=0.331、1和0.406),p53的表达也与p CR和TRG无明显相关(P=1、0.331),但p53野生型的患者在影像学上显示肿瘤有更明显的退缩(P=0.028)。结论:塞来昔布联合放化疗在局部晚期直肠癌中的应用安全有效,BCCIP正常表达的病人采用塞来昔布联合术前放化疗后获得更好的疗效。BCCIP有可能成为预测局部晚期直肠癌术前放化疗疗效的指标,并有希望成为临床使用塞来昔布联合放疗增敏的局部晚期直肠癌适应人群的初步筛选指标。