聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)是一种体外快速扩增特定DNA片段的技术,它是现代分子生物学最重要的研究手段之一。耐热DNA聚合酶的发现被誉为分子生物学资源发展史上的里程碑之一,它是PCR技术得到广泛应用的催化剂。近年来,如何提高耐热DNA聚合酶的产量,简化生产、纯化步骤已经成为研究的热点。虽然巴斯德毕赤酵母表达系统因其表达量高,自身分泌蛋白少,易于分离纯化,大规模工业化生产技术成熟等优势已经被用来表达了数百种重组蛋白质,但是目前国内外尚无耐热DNA聚合酶在毕赤酵母中成功表达的相关报道。　　 本研究在本实验室已有的基础上利用定点诱变等技术构建了重组耐热DNA聚合酶RKOD基因,经测序正确后,克隆至毕赤酵母(Pichia pastoris)分泌型表达载体pHBM905A,获得毕赤酵母重组表达质粒,随后将此质粒经salⅠ酶切线性化后电转化入毕赤酵母宿主菌GS115,经MD平板及PCR验证筛选出阳性克隆,摇瓶培养,0.5％甲醇诱导分泌性表达,取上清液进行SDS-PAGE鉴定。同时,将提取的粗酶液运用PCR技术进行功能验证。结果表明,本研究成功构建了重组耐热DNA聚合酶RKOD真核毕赤酵母表达载体,重组质粒酶切和核酸测序结果与预期一致,并实现了RKOD在毕赤酵母菌中的分泌性表达。用Bradford法测得其表达量约为181mg/L,热稳定性分析表明其在100℃处理3h后仍然有活性,明显优于大肠杆菌中表达。此外,该酶可以实现对广泛靶序列的高保真性、高特异性、高效性扩增,扩增得到的产物几乎都为平滑末端,可直接克隆于平滑末端的载体中。　　 本研究利用毕赤酵母分泌型表达载体成功表达了耐热DNA聚合酶,进一步节约了生产成本,缩短了工艺流程,简化了纯化步骤,为利用毕赤酵母规模化生产高保真耐热DNA聚合酶奠定了技术基础,也为分子生物学创新实验的开设和PCR技术的优化开辟了新的途径。