杆菌肽是一种环状肽类抗生素,是由多种氨基酸合成的短肽,包含了 11种氨基酸,12个氨基酸残基。杆菌肽广泛的用于饲料添加,杆菌肽的主要生产菌株是地衣芽胞杆菌和枯草芽胞杆菌。目前,已探索出多种基因水平的策略来提高杆菌肽的产量。有研究发现,杆菌肽的组成氨基酸的可利用性在杆菌肽合成过程中发挥重要作用。作为中枢代谢途径,TCA循环是氨基酸合成代谢中间体的主要来源,也为氨基酸合成与转运提供主要能量供应。本研究通过增强TCA循环关键酶以及TCA添补反应的表达来增强TCA循环代谢流。同时,检测了地衣芽胞杆菌对于TCA循环增强的代谢反应,提供了一种提高杆菌肽产量的策略。在TCA循环中起关键调节作用的酶主要是3种:柠檬酸合成酶、异柠檬脱氢酶和α-酮戊二酸脱氢酶,其中α-酮戊二酸脱氢酶的催化反应可能降低氨基酸衍生的重要前体中间体α-酮戊二酸的胞内含量,所以本研究选择了编码柠檬酸合成酶的基因citZ和mmgD和编码异柠檬酸脱氢酶的基因icd,通过基因工程方法构建这些基因的游离表达型菌株。发酵结果显示游离表达icd基因的工程菌杆菌肽产量比原始菌株DW2提高了7.7%,比对照菌DW2/pHY300PLK提高了 25.9%,而游离表达citZ基因的工程菌的杆菌肽产量较原始菌株DW2有所降低,但比对照菌株DW2/pHY300PLK分别提高了13.9%,游离表达mmgD基因的工程菌株产量明显下降,且低于对照菌株DW2/pHY300PLK。在上述的游离表达菌株中,icd基因游离表达菌株对杆菌肽产量提高最大,说明icd基因的过表达可以提高杆菌肽的产量。为了消除质粒对菌株的影响,本研究构建了 icd整合表达菌株。发酵结果显示icd整合表达菌株杆菌肽产量比游离表达icd基因的工程菌提高了 4%,比原始菌株DW2提高了 11.5%。异柠檬酸脱氢酶(ICDH)的酶活测定结果显示,在过表达菌株中,ICDH的酶活力比原始菌株提高了2.7 倍。为了探究icd基因增强表达对菌株代谢的影响,通过检测icd基因过表达菌株与原始菌株的ATP和NADPH供应,发现其ATP与NADPH的含量均得到了显著提高。然后通过qRT-PCR确定过表达菌株与原始菌株基因转录水平上的差异,结果显示,在icd基因过表达菌株中,TCA循环中几种酶的编码基因的转录水平均得到了提高。同时,转录调控因子CcpA和CcpC的转录水平在过表达菌株中受到抑制,而谷氨酸合成酶编码基因gltA以及谷氨酸脱氢酶编码基因rocG的转录水平比原始菌株分别提高了 3.4和3.5倍。最后,对过icd基因表达菌株及原始菌株胞内胞外的氨基酸含量进行测定,结果显示,在ICDH过表达菌株中,胞外氨基酸吸收得到加强且胞内氨基酸的含量均高于原始菌株。表明ICDH过表达菌株中TCA循环得到增强,为氨基酸合成提供了更多的前体物质,增强了氨基酸胞内合成。综上所述ICDH过表达可以提高TCA循环的代谢,并且提供更多的前体物质和能量,加强了杆菌肽组成氨基酸的吸收和合成,实现杆菌肽增产的目的。本研究还通过对丙酮酸羧化酶催化的由丙酮酸羧化形成草酰乙酸的添补反应的强化,来获得TCA循环强化菌株。构建丙酮酸羧化酶过表达菌株DW2/pHY-pycA,发酵结果显示DW2/pHY-pycA的杆菌肽产量较原始菌株DW2有所降低,但是与对照菌株DW2/pHY300PLK相比,产量提高了 14.5%。通过发酵过程中生物量的检测发现pycA游离表达菌株的生物量有明显提高。然后qRT-PCR检测TCA循环的相关基因的转录水平,发现,DW2/pHY-pycA中,TCA循环所有酶的编码基因的转录水平均有所上升。然后对胞内草酰乙酸含量进行检测,发现DW2/pHY-pycA中草酰乙酸的含量有所提高。这些结果表明,在pycA过表达,可以增强TCA循环,草酰乙酸含量的提高,为杆菌肽组成氨基酸Asp、Asn、Lys和Ile的提供了更多的前体物质。本文通过增加TCA循环代谢,生成更多用于氨基酸生物合成及吸收的能量和前体物质,提高胞内杆菌肽组成氨基酸的可用性,对杆菌肽的生物合成起促进增强作用。