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副溶血性弧菌作为一种革兰氏阴性食源性致病菌,广泛存在于鱼、虾、蟹和贝壳类等水产品中。近年来,海产品中副溶血性弧菌的爆发使给人们的食品安全带来巨的隐患,引发腹痛、腹泻、呕吐等中毒现象。随着抗生素的滥用副溶血性弧菌的耐药水平不断提高,为抗生素治疗受感染患者带来困难。然而,关于副溶血性弧菌耐药机制目前尚不完全清楚。解析副溶血性弧菌耐药机制对新型抗菌药的研制具有十分重要的意义。本文以副溶血性弧菌ATCC33846为研究对象,首先比较了解其对19种抗菌药的耐受能力,然后通过转录组学分析了其耐受多粘菌素和氨苄青霉素的相关基因,最后重点研究了副溶血性弧菌对多粘菌素的高度耐受机制。本论文主要研究结果如下:（1）初步测定副溶血性弧菌ATCC33846的嗜盐性和耐药性。通过抗生素药敏试纸片分析发现副溶血性弧菌对多粘菌素B、氨苄青霉素、阿莫西林和林可霉素表现出高度耐药性。将副溶血性弧菌分别在含1.5%、2.5%和3.5%Na Cl的LB固体培养基中培养,观察细菌生长、细胞形态和抑菌圈大小,发现在1.5%Na Cl LB培养基上,菌膜形成能力增强,对抗生素耐药更显著。测定了副溶血性弧菌和大肠杆菌对19种抗生素的MIC值。发现与大肠杆菌相比,副溶血性弧菌对阳离子抗菌肽类药物（多粘菌素B和多粘菌素E）和β-内酰胺类药物（氨苄青霉素和阿莫西林）表现出高度耐受性。针对多粘菌素B、多粘菌素E和氨苄青霉素的MIC值,副溶血性弧菌分别为64、130和6000μg/m L,而大肠杆菌分别为2、0.5和15μg/m L。（2）基于转录组学分析研究了副溶血性弧菌耐受AMP的机制。通过分析AMP压力下副溶血性弧菌ATCC33846的转录组学,发现670个基因转录水平显著上调。选取上调最明显的bla A、VPA0510、VPA0252、VPA0699、VPA0768、VPA0320、VP0636、V PA1096、VPA0947和VP1775基因分别在副溶血性弧菌ATCC33846中进行过表达,发现AMP压力下,这些基因过表达菌株生长速度明显改善。其中最显著的是VP0636和VPA0947基因,它们的过表达菌株对AMP耐受性与bla A（已知的AMP耐受基因）过表达菌株达到了相同水平。发现副溶血性弧菌中双组分系统Vbr K/Vbr R调控β-内酰胺酶表达,其缺失菌株表现出对AMP极度敏感性。转录组学分析还显示外膜蛋白Omp A、细胞抗氧化系统、能量代谢和氨基酸合成等相关基因表达水平也发生了显著变化。（3）通过转录组学分析研究了副溶血性弧菌对多粘菌素B的耐药机制。多粘菌素B压力下副溶血性弧菌中与合成LPS相关的基因转录水平上调。液质联用分析发现多粘菌素B压力下副溶血性弧菌合成的类脂A脂肪酸链数目增加,而且类脂A结构被磷酸乙醇胺修饰;同时磷脂组成和分子结构也发生改变,PG占比增加,并合成了三条链的酰基-PG。转录组学分析还发现多粘菌素B压力下副溶血性弧菌中双组分系统、硫代谢、核糖体、阳离子抗菌肽抗性、柠檬酸循环、丙酮酸代谢、不同环境中的代谢、ABC转运蛋白、抗生素的生物合成、细菌分泌系统和氨酰-t RNA生物合成等基因的转录水平也发生显著变化。（4）发现副溶血性弧菌Pmr A/Pmr B、Pho P/Pho Q和Cpx A/Cpx R双组分调控系统对多粘菌素耐药的影响。通过敲除Pmr A/Pmr B和Pho P/Pho Q双组分调控系统相关基因,构建了突变菌株ATCC33846Δpmr A、ATCC33846Δpmr B、ATCC33846Δpho P、ATCC33846Δpho Q、ATCC33846Δpmr F和ATCC33846Δpmr K。液质联用分析发现,ATCC33846Δpmr A、ATCC33846Δpmr B、ATCC33846Δpho P和ATCC33846Δpho Q菌株中磷脂分子量变小,表明其含有较短的脂肪酸链,降低对多粘菌素B的耐药性;ATCC33846Δpmr F菌株中类脂A被添加1条C16:0次级脂肪酸链和1个磷酸乙醇胺基团修饰,增加对多粘菌素B的耐药性;ATCC33846Δpmr K菌株中类脂A上磷酸乙醇胺修饰丢失,降低对多粘菌素B的耐药性。删除Cpx A/Cpx R双组分系统相关基因,ATCC33846Δcpx A、ATC C33846Δcpx R和ATCC33846Δcpx AR突变菌株中编码类脂A次级脂肪酸链转移酶的基因VP＿RS01045和VP＿RS08405转录水平明显升高,1条C14:0次级脂肪酸链被添加,增加对多粘菌素B的耐药性。（5）发现VP＿RS21300基因在副溶血性弧菌高度耐受多粘菌素和致病能力方面起关键作用。通过BLAST发现副溶血性弧菌VP＿RS21300基因与大肠杆菌ept A基因同源性较高。在大肠杆菌中敲除ept A基因并过表达VP＿RS21300基因,提取纯化类脂A并进行质谱结构分析,发现类脂A的1位或4’位-磷酸上多了一个磷酸乙醇胺基团,说明副溶血性弧菌VP＿RS21300基因编码类脂A磷酸乙醇胺转移酶。在副溶血性弧菌中敲除VP＿RS21300基因,导致其类脂A结构上的磷酸乙醇胺消失,再次证明了副溶血性弧菌VP＿RS21300基因编码类脂A磷酸乙醇胺转移酶。野生型副溶血性弧菌ATCC33846对多粘菌素B和多粘菌素E的MIC值分别是VP＿RS21300基因缺失菌ATCC33846ΔRS21300的45.7和42.2倍,说明VP＿RS21300基因在副溶血性弧菌高度耐受多粘菌素方面起关键作用。RAW264.7细胞受ATCC33846ΔRS21300菌株刺激后的存活率是ATCC33846菌株刺激后的2.8倍,说明VP＿RS21300基因在副溶血性弧菌致病能力方面也起关键作用。