论文部分内容阅读
肝功能衰竭是肝病患者重要死亡原因之一,目前最有效的治疗措施是原位肝移植,但供肝短缺限制了其临床应用。肝细胞移植及生物型人工肝(BAL)作为肝移植的替代或补充治疗手段,所需的肝细胞也面临着来源紧缺、体外增殖困难、功能很快丧失等问题。寻找合适的细胞来源已成为限制肝细胞移植及BAL临床应用的瓶颈。胚胎干细胞(ESCs)可以诱导分化为肝细胞,但ESCs存在伦理学及异体免疫排斥问题,诱导性多能干细胞(iPSCs)避免了伦理问题,且由患者体细胞诱导生成的iPSCs应用于患者自身有可能避免免疫排斥反应。有望成为肝细胞移植及BAL所需肝细胞的理想来源。虽然目前已成功将iPSCs诱导生成肝细胞,但诱导效率及生成的肝细胞功能都很低,无法满足进一步基础和临床研究需要。目的：1.建立稳定的人诱导多能干细胞(hiPSCs)维持培养体系及诱导hiPSCs向肝细胞分化的方法；2.通过采用肝切除患者不同时间血清代替胎牛血清(FBS),提高诱导hiPSCs向肝细胞分化效率及生成的肝细胞功能；3.初步探讨人血清在维持肝细胞培养中代替FBS的可行性以及肝切除术后血清与肝细胞增殖的时效关系。方法：1.采用CF-1小鼠成纤维细胞作为饲养层细胞,在DMEM/F12培养基中添加碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)及β-巯基乙醇等进行饲养层培养；采用mTeSRl培养基联合Matrigel基质胶进行无饲养层培养。2.模拟体内ESCs向肝细胞分化过程经历定型内胚层、肝前体细胞及成熟肝细胞等3个阶段,在不同阶段分别添加bFGF、活化素A,肝细胞生长因子(HGF)、地塞米松等不同的细胞因子或激素,建立体外诱导hiPSCs向肝细胞分化的诱导体系。3.应用实验二建立的hiPSCs向肝细胞分化的阶段诱导方法,根据采用FBS或肝切除术前及术后3小时、1天、3天不同时间血清分为FBS组、PRE-HS组、POST3H-HS组、POST1D-HS组、POST3D-HS组,诱导hiPSCs向肝细胞分化,并通过流式细胞仪、免疫荧光染色、白蛋白分泌及尿素合成功能、糖原合成功能、吲哚青绿摄取功能检测各组诱导生成肝细胞的功能及诱导效率。4.分别采用FBS及肝切除患者术前及术后0.5小时、3小时、24小时、72小时不同时间血清维持HL-7702细胞培养,通过Cell-IQ活细胞影像分析系统及BrdU免疫荧光染色比较不同血清对HL-7702细胞增殖能力的影响。结果：1.饲养层培养和无饲养层培养hiPSCs传代数代后碱性磷酸酶染色及Oct4免疫荧光染色均呈阳性,提示两种培养方法均可维持hiPSCs的多能性及无限增殖能力。2.成功建立了稳定的hiPSCs向肝细胞分化的阶段诱导方法,诱导效率为18.1%,诱导生成的细胞能够表达肝细胞特异性标志物去唾液酸糖蛋白酶受体(ASGPR1)、白蛋白(ALB)及甲胎蛋白(AFP),而且具备一定的糖原合成和吲哚青绿摄取功能。3.流式细胞仪检测显示POST3H-HS、 POST1D-HS组诱导效率明显高于FBS组：ELISA检测细胞培养上清液ALB浓度显示人源性血清诱导生成的细胞ALB浓度明显高于FBS组(P<0.05),POST3H-HS和POSTID-HS组又明显高于PRE-HS组(P<0.05)；化学比色法检测细胞培养上清液尿素浓度显示PRE-HS,POST3H-HS和POSTID-HS组尿素浓度高于FBS组(P<0.05),POST3H-HS和POSTID-HS组高于PRE-HS组(P<0.05)；免疫荧光染色结果显示：人源性血清诱导生成的细胞ALB表达强度明显强于FBS诱导生成的细胞,POST3H-HS和POSTID-HS组强于PRE-HS组;POST3H-HS和POSTID-HS组AFP表达强度较FBS组、PRH-HS组更强；POST3H-HS和POSTID-HS组糖原合成功能及吲哚青绿摄取功能强于FBS组和PRE-HS组。4.Cell-IQ活细胞影像分析结果显示,各组人源性血清培养细胞扩增倍数明显高于FBS组(P<0.05),术后0.5h和术后3h血清组明显高于术前血清组(P<0.05)。BrdU免疫荧光染色显示人源性血清培养的细胞BrdU阳性率均高于FBS培养的细胞(P<0.05),术后0.5h和术后3h血清培养的细胞BrdU阳性率高于术前血清(P<0.05)。结论：1.人血清在诱导hiPSCs向肝细胞分化过程中完全可以取代FBS,并且(尤其是肝切除术后3小时和24小时血清)诱导生成的肝细胞功能更强,诱导效率更高。2.人血清促进肝细胞增殖的能力明显强于FBS,肝切除术后血清对肝细胞增殖的影响具有明显的时效性。