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目的:蜈蚣三七(曾用名地乌)系毛莨科银莲花属植物林荫银莲花的干燥根茎，其性温，味辛微苦具有祛风湿、强筋骨、消肿止痛之功效，善治风湿疼痛、跌打损伤。湖北中医学院中药研究所由蜈蚣三七中得到蜈蚣三七提取物，制成地乌风湿安胶囊，用于治疗类风湿性关节炎(RA)，与2004年9月2日获国家五类中药新药的临床研究批件，现处于3期临床实验阶段。地乌风湿安胶囊通过实验投入生产后，可预见其原料临床需求量会不断增加。由于蜈蚣三七原植物林荫银莲花生长周期长、分布海拔高、人工栽培较困难，通过化学合成其药用活性成分蜈蚣三七皂苷W3是解决林荫银莲花植物资源匮乏的重要策略之一。人工合成方法与从植物中分离蜈蚣三七皂苷W3相比，具有不受资源限制、方法简便、成本低、耗时短、适宜于规模化生产的优势。
大量实验研究证明，毛茛科银莲花属植物有较好的抗肿瘤活性，本课题将用合成的蜈蚣三七皂苷W3、蜈蚣三七皂苷、齐墩果酸三种药物，分别作用于人肝癌Hep3B细胞、Hel人胚肺细胞，进行体外抗肿瘤研究，探讨中药成分或单体的作用机理，验证合成的W3与蜈蚣三七皂苷具有相似甚至更好的活性，为进一步研究蜈蚣三七成分的药理学毒性及开发新药提供实验基础。
方法:
一.蜈蚣三七有效成分W3的半合成
利用葡萄糖(C6H12O6)、L-鼠李糖(C6H12O5)、D-木糖(C5H10O5)、齐墩果酸(C30H48O3)等单糖制得化合物1(2，3-二-0-乙酰基-4，6-0-苄叉-β-D-葡萄糖乙硫苷)，化合物6(2，3，4，6-四-0-乙酰基-β-D-葡萄糖对甲氧基苯酚氧苷)，化合物4(2，3，4-三-0-苯甲酰基-α-L-鼠李吡喃糖三氯乙酰亚胺酯)，化合物11(3，4-二-0-乙酰基-1，2-0-原甲酸酯-α-D-吡喃木糖)，化合物17(齐墩果酸三苯基甲基酯)。再以化合物1、4、6、11和17为原料，采用汇聚式路线，完成W3的半合成。
二.合成的W3抗肿瘤作用实验
1.药物分组：本实验分为6个组，分别为蜈蚣三七总苷、合成的W3以及齐墩果酸，同时设立阳性药物对照组(顺铂)、DMSO(二甲基亚砜)组、空白对照组(未加药组)。
2.采用噻唑蓝(MTT)还原法测定各实验组对Hep3B细胞、Hel细胞的生长抑制率。
3.倒置显微镜观察各组药物作用于Hep3B细胞、Hel细胞48h后的形态学变化。
4.透射电镜进行细胞超微结构观察。
5.流式细胞仪检测各组药物作用后Hep3B细胞细胞周期分布和凋亡率。
6.统计学分析。采用统计软件SPSS15.0分析，用独立样本的t检验，X2检验对统计数据进行分析，如有差异，多组间参数两两比较采用q检验。以a=0.05为检验水准。(1)Y轴为细胞存活率，X轴为药物浓度，制作细胞生长曲线。(2)利用公式计算细胞48小时细胞增殖抑制率。(3)通过EXCEL画图法做趋势线来求48小时IC50值。
结果:
一.蜈蚣三七有效成分W3的半合成
完成蜈蚣三七有效成分W3的合成，纯度达到90％。
二.合成的W3抗肿瘤作用实验
1.不同浓度不同药物分组的药物作用于体外培养的Hep3B细胞、Hel细胞48h后，各实验组生长抑制率结果如下：
1.1 Hep3B细胞：合成的W3、蜈蚣三七总苷、齐墩果酸均对Hep3B细胞有增殖抑制作用。
1.2 Hel细胞：W3、蜈蚣三七总苷均对Hel细胞无明显的细胞抑制作用。
2.药物作用后，Hep3B细胞的形态学变化倒置显微镜下观察到：
2.1空白对照组：Hep3B细胞贴壁生长，弥散蔓延分布，呈纺锤形或多角形，细胞透亮，生长状态良好。
2.2DMSO组：DMSO作用于Hep3B细胞与空白对照组比较生长情况无明显的差异。
2.3W3组：细胞数量显著减少，细胞相互分离，透亮度差，贴壁大量减少，细胞体积明显缩小，变圆，可见大量细胞崩解碎片，细胞核缩小或崩解消失，核染色质边聚，可见裸露的核。以中剂量组效果最好。
2.4蜈蚣三七总苷组：细胞数量减少，体积变小，收缩变圆，可见裸露的核，细胞肿胀，形成空泡。以高剂量组效果较好。
2.5齐墩果酸组：细胞数量减少，体积变小，收缩变圆。效果略逊于蜈蚣三七总苷。
2.6顺铂组：细胞数量明显减少，细胞破坏形成碎片，细胞溶解，可见裸露的细胞核。
3.电镜进行细胞超微结构观察
3.1空白对照组：可见Hep3B细胞包膜完整，细胞质中细胞器分布均匀，线粒体大小均匀，细胞核清晰，核膜完整。
3.2 W3组：细胞核浓缩，细胞核挤向一边，染色质深染，聚集成团，胞浆浓缩，细胞质萎缩，细胞器肿胀变形，拥挤，细胞膜破裂，绒毛消失，细胞肌浆网明显扩张呈巨大空泡状，线粒体退行性变，肿胀、结构破坏，嵴紊乱、稀疏。
3.3蜈蚣三七总苷组：可见细胞核收缩，核质浓缩边聚。细胞病变明显轻于W3组。
4.流式细胞仪检测Hep3B细胞的凋亡率。体外培养的Hep3B细胞经W3药物高剂量作用后细胞碎片及早期凋亡细胞较空白对照组高。经W3药物中剂量作用后可见大量的细胞碎片及早期凋亡细胞，晚期凋亡细胞或者坏死细胞也高于空白对照组。经W3药物低剂量作用后可见大量的细胞碎片。经蜈蚣三七总苷中剂量作用后出现了晚期凋亡细胞及坏死细胞及早期凋亡细胞，晚期凋亡细胞或者坏死细胞百分率明显高于空白对照组，经齐墩果酸高剂量作用后可见大量的细胞碎片。
结论:
1.本课题所采用的W3半合成路线有效可行。
2.W3、蜈蚣三七总苷、齐墩果酸均对Hep3B细胞的有增殖抑制作用。对Hel细胞无明显的细胞抑制作用。
3.形态学变化(光镜、电镜)：W3中剂量的Hep3B细胞毒效果最好，蜈蚣三七总苷次之，母核齐墩果酸再次之。
4.经流式细胞仪检测Hep3B细胞的凋亡率，结果说明W3其作用机制可能主要与杀伤Hep3B细胞及诱导细胞凋亡有关。蜈蚣三七总苷其作用机制可能主要与诱导细胞凋亡有关。母核齐墩果酸其作用机制可能主要与杀伤Hep3B细胞有关。其中W3的抗肿瘤作用最强。
大量实验研究证明，毛茛科银莲花属植物有较好的抗肿瘤活性，本课题将用合成的蜈蚣三七皂苷W3、蜈蚣三七皂苷、齐墩果酸三种药物，分别作用于人肝癌Hep3B细胞、Hel人胚肺细胞，进行体外抗肿瘤研究，探讨中药成分或单体的作用机理，验证合成的W3与蜈蚣三七皂苷具有相似甚至更好的活性，为进一步研究蜈蚣三七成分的药理学毒性及开发新药提供实验基础。
方法:
一.蜈蚣三七有效成分W3的半合成
利用葡萄糖(C6H12O6)、L-鼠李糖(C6H12O5)、D-木糖(C5H10O5)、齐墩果酸(C30H48O3)等单糖制得化合物1(2，3-二-0-乙酰基-4，6-0-苄叉-β-D-葡萄糖乙硫苷)，化合物6(2，3，4，6-四-0-乙酰基-β-D-葡萄糖对甲氧基苯酚氧苷)，化合物4(2，3，4-三-0-苯甲酰基-α-L-鼠李吡喃糖三氯乙酰亚胺酯)，化合物11(3，4-二-0-乙酰基-1，2-0-原甲酸酯-α-D-吡喃木糖)，化合物17(齐墩果酸三苯基甲基酯)。再以化合物1、4、6、11和17为原料，采用汇聚式路线，完成W3的半合成。
二.合成的W3抗肿瘤作用实验
1.药物分组：本实验分为6个组，分别为蜈蚣三七总苷、合成的W3以及齐墩果酸，同时设立阳性药物对照组(顺铂)、DMSO(二甲基亚砜)组、空白对照组(未加药组)。
2.采用噻唑蓝(MTT)还原法测定各实验组对Hep3B细胞、Hel细胞的生长抑制率。
3.倒置显微镜观察各组药物作用于Hep3B细胞、Hel细胞48h后的形态学变化。
4.透射电镜进行细胞超微结构观察。
5.流式细胞仪检测各组药物作用后Hep3B细胞细胞周期分布和凋亡率。
6.统计学分析。采用统计软件SPSS15.0分析，用独立样本的t检验，X2检验对统计数据进行分析，如有差异，多组间参数两两比较采用q检验。以a=0.05为检验水准。(1)Y轴为细胞存活率，X轴为药物浓度，制作细胞生长曲线。(2)利用公式计算细胞48小时细胞增殖抑制率。(3)通过EXCEL画图法做趋势线来求48小时IC50值。
结果:
一.蜈蚣三七有效成分W3的半合成
完成蜈蚣三七有效成分W3的合成，纯度达到90％。
二.合成的W3抗肿瘤作用实验
1.不同浓度不同药物分组的药物作用于体外培养的Hep3B细胞、Hel细胞48h后，各实验组生长抑制率结果如下：
1.1 Hep3B细胞：合成的W3、蜈蚣三七总苷、齐墩果酸均对Hep3B细胞有增殖抑制作用。
1.2 Hel细胞：W3、蜈蚣三七总苷均对Hel细胞无明显的细胞抑制作用。
2.药物作用后，Hep3B细胞的形态学变化倒置显微镜下观察到：
2.1空白对照组：Hep3B细胞贴壁生长，弥散蔓延分布，呈纺锤形或多角形，细胞透亮，生长状态良好。
2.2DMSO组：DMSO作用于Hep3B细胞与空白对照组比较生长情况无明显的差异。
2.3W3组：细胞数量显著减少，细胞相互分离，透亮度差，贴壁大量减少，细胞体积明显缩小，变圆，可见大量细胞崩解碎片，细胞核缩小或崩解消失，核染色质边聚，可见裸露的核。以中剂量组效果最好。
2.4蜈蚣三七总苷组：细胞数量减少，体积变小，收缩变圆，可见裸露的核，细胞肿胀，形成空泡。以高剂量组效果较好。
2.5齐墩果酸组：细胞数量减少，体积变小，收缩变圆。效果略逊于蜈蚣三七总苷。
2.6顺铂组：细胞数量明显减少，细胞破坏形成碎片，细胞溶解，可见裸露的细胞核。
3.电镜进行细胞超微结构观察
3.1空白对照组：可见Hep3B细胞包膜完整，细胞质中细胞器分布均匀，线粒体大小均匀，细胞核清晰，核膜完整。
3.2 W3组：细胞核浓缩，细胞核挤向一边，染色质深染，聚集成团，胞浆浓缩，细胞质萎缩，细胞器肿胀变形，拥挤，细胞膜破裂，绒毛消失，细胞肌浆网明显扩张呈巨大空泡状，线粒体退行性变，肿胀、结构破坏，嵴紊乱、稀疏。
3.3蜈蚣三七总苷组：可见细胞核收缩，核质浓缩边聚。细胞病变明显轻于W3组。
4.流式细胞仪检测Hep3B细胞的凋亡率。体外培养的Hep3B细胞经W3药物高剂量作用后细胞碎片及早期凋亡细胞较空白对照组高。经W3药物中剂量作用后可见大量的细胞碎片及早期凋亡细胞，晚期凋亡细胞或者坏死细胞也高于空白对照组。经W3药物低剂量作用后可见大量的细胞碎片。经蜈蚣三七总苷中剂量作用后出现了晚期凋亡细胞及坏死细胞及早期凋亡细胞，晚期凋亡细胞或者坏死细胞百分率明显高于空白对照组，经齐墩果酸高剂量作用后可见大量的细胞碎片。
结论:
1.本课题所采用的W3半合成路线有效可行。
2.W3、蜈蚣三七总苷、齐墩果酸均对Hep3B细胞的有增殖抑制作用。对Hel细胞无明显的细胞抑制作用。
3.形态学变化(光镜、电镜)：W3中剂量的Hep3B细胞毒效果最好，蜈蚣三七总苷次之，母核齐墩果酸再次之。
4.经流式细胞仪检测Hep3B细胞的凋亡率，结果说明W3其作用机制可能主要与杀伤Hep3B细胞及诱导细胞凋亡有关。蜈蚣三七总苷其作用机制可能主要与诱导细胞凋亡有关。母核齐墩果酸其作用机制可能主要与杀伤Hep3B细胞有关。其中W3的抗肿瘤作用最强。