研究背景脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤,约占颅内肿瘤的40%-60%。其中又以胶质母细胞瘤恶性程度最高。由于其呈浸润性生长,单纯手术往往难以根治,术后复发率很高,生存期平均为14个月。目前,对于胶质瘤患者多采取综合治疗,包括手术切除、放疗和化疗。几十年来,虽然神经影像学技术和显微外科技术取得巨大的进步,极大地推动了神经外科的发展,但手术仍难以彻底的切除肿瘤。虽然手术后辅以放疗可以提高胶质廇的治疗效果,但由于放射剂量的限制和有相当一部分肿瘤对放疗不敏感,大多数肿瘤出现治疗后复发的现象。而且,现行的化疗药物由于耐药性及难以透过血脑屏障等原因亦没取得理想的疗效。在胶质瘤的发生过程中,一些相关基因或蛋白出现变化及更改,在不同的信号途径对肿瘤的发生、细胞增殖、肿瘤转移或凋亡起着重要作用。如表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR/ErbB1)基因的过表达和扩增,血小板源生长因子受体(platelet-derived growth factor recetor, PDGFR)的表达上调、控制细胞周期的INK4A-ARF的缺失、促进细胞凋亡的p53的突变或丢失等等,与肿瘤的发生及发展密切相关。而针对这些基因或蛋白的的基因靶向治疗方法大多正处于研究阶段,尚未进入临床。目前,化疗药物的辅助治疗胶质瘤治疗,提高生存率仍是的胶治疗治疗研究的热点。青蒿素(Artemisinin)是1971年我国科学家从菊科植物黄花蒿的叶和花蕾中分离获得的一种倍半萜内酯过氧化物,其衍生物包括：双氢青蒿素(DHA)蒿甲醚、青蒿琥酯等。目前,青蒿素及其衍生物作为高效低毒的抗疟药已经得到了全世界的公认。近10多年来国内外学者研究发现青蒿素及其衍生物对体内外多种细胞有明显的诱导凋亡作用,特别是诱导肿瘤细胞凋亡。因此青蒿素被认为具有广谱抗癌活性。并从青蒿素对肿瘤细胞的直接细胞毒性作用、影响肿瘤细胞的增殖周期、促进肿瘤细胞凋亡及抗肿瘤血管生成作用等多个方面,对青蒿素的抗肿瘤活性机制时行研究。(1)氧自由基介导的细胞毒性作用。青蒿素作为一种抗疟疾药物,其目前公认的主要机制抗疟疾机制为：青蒿素类药物具有过氧化桥的新型倍半萜内酯的结构,与亚铁原子起反应后,过氧桥断裂产生自由基等细胞内活性氧(ROS)代谢产物,能引起细胞死亡。有研究表明,细胞对铁的摄取与细胞表面的转铁蛋白受体有关。在细胞分裂时,DNA复制需要铁离子。而肿瘤细胞生长旺盛,分裂活跃,需要大量的铁离子,故肿瘤细胞的铁含量比正常细胞高出很多。因此,在肿瘤细胞中铁含量远比正常细胞多的情况下,青蒿素对肿瘤细胞的作用,远大于正常细胞。这提示了青蒿素作用于肿瘤细胞产生的ROS远多于正常细胞,对肿瘤细胞产生毒性作用更大。可能是青蒿素及其衍生物选择性抗肿廇的机制之一。(2)细胞周期阻滞作用。细胞周期是指细胞完成一分为二复制生长周期。静止的细胞,不进行分裂活动,称为Go期,周期开始于一个起始点,由此静细胞进入G1期,继之为S期,即DNA合成期,然后进入G2期,最后细胞一分为二,是为M期,即分裂期。细胞周期有两个关键的过渡控制点：一在G2/M的交接处,一在G1/S期。许多实验中观察到,青蒿素类药物作用肿瘤细胞后,细胞出现细胞周期阻滞现象。而不同部位组织的细胞,阻滞周期有所不同。这可能是青蒿素对不同部位肿瘤细胞的周期阻滞有一定的选择性。但这种选择性周期阻滞机制仍未明确。(3)诱导肿瘤细胞凋亡作用。细胞调亡是细胞程序性死亡。凋亡细胞出现特殊的形态改变和DNA裂解,这被认为是细胞凋亡过程的主要病理学标志。诱导细胞凋亡的原因及路径很多。普遍认为已明确的细胞凋亡途径有两条。分别是：死亡受体途径和线粒体途径。对于青蒿素诱导肿瘤细胞凋亡的机制,目前在不同组织肿瘤细胞中的研究结果出现许多观点。以HL60细胞、A549细胞为模型研究发现,survivin mRNA和：survivin蛋白的表达均降低。因此,有学者认为ART诱导肿廇细胞凋亡效应的机制,与IAPs家族成员survivin基因的表达受抑制有关。在研究青蒿酯钠诱导肝癌细胞BEL-7402凋亡作用时,研究人员发现肝癌细胞中p53、p21蛋白表达水平无明显变化,而bcl-2蛋白表达水平降低,从而认为青蒿素诱导凋亡的分子机制是p53非依赖性的,与凋亡基因bcl-2下调有关。DHA诱导Hela细胞死亡实验结果,显示青蒿素诱导凋亡的分子机制为依赖线粒体途径的非p53依赖性凋亡。但在结肠癌细胞株中,研究者却认为,ART的作用主要是通过P53依赖性与非依赖性途径介导细胞凋亡的。这些不同部位肿瘤细胞研究结果显示,青蒿素诱导不同肿瘤细胞凋亡的分子机制存在差异。另外,有学者研究认为,细胞内过氧化桥的激活是细胞内过氧化物导致的细胞死亡的原因。ART抗肝癌作用机理与其影响拓扑异构酶介导的细胞凋亡有关。此外,细胞内Ca2+浓度升高,引发的阻断环磷酸腺苷介导的信号传导途径有关。我国学者研究发现,DHA可诱导肺癌细胞凋亡,并伴随有线粒体形态改变和caspase-3活化。提示DHA可能通过独立caspase-3线粒体死亡途径,抑制和诱导肺癌细胞凋亡。目前,关于青蒿素诱导胶质细胞瘤凋亡,特别是诱导恶性胶质瘤细胞的凋亡机制尚未明确。(4)抑制血管生成作用。新生血管过度生长是多种病理过程的主要特点尤其是肿瘤快速生长和转移的重要基础。大量实验证明,多种肿瘤生成、转移、复发和愈后均与血管生成密切相关。血管生成是一个复杂的过程,要经历血管内皮的增殖和迁移、实心条索的形成、管壁的胶原沉积以及外周细胞的形成等多个步骤才能完成。针对血管生成过程,进行青蒿素抑制新生血管的实验研究发现,青蒿素能明显推迟血管新生,减少新生血管数量。这提示了,青蒿素可能与抑制血管新生的起始步骤,即与血管内皮的增殖与迁移、管状形成有关。实验还发现,青蒿素在瘤血管生成中可抑制VEGF与受体结合,下调血管内皮细胞上VEGF及其受体表达。提示ART在抗肿瘤血管生成中具有潜在的应用价值。青蒿素的安全性。青蒿素及其衍生物作为一种广泛应用的抗疟疾药,其毒副作用分析在临床上鲜有报道。在一项超过一万人临床试验中,经严密观察,尚未有临床相关毒副作用的报道。在动物实验上,出现的毒性反应都是在使用高剂量情况下发生的。针对毒副作用的研究显示,青蒿素及其衍生物的毒副作用,主要包括对造血系统抑制,胚胎毒性作用,神经毒性等。在神经毒性方面,主要针对神经元细胞,而非胶质细胞。另外,不同部位脑组织青蒿素的敏感性亦存在差异。例如,位于低位脑干的斜方体核、巨细胞网状核、与小脑下脚的神经元对蒿甲醚的毒性作用最敏感,而脑皮层神经元则较少受影响。体外研究表明,神经毒性呈剂量与时间依赖性的。另外,有研究发现发现青蒿素类药物肌肉注射比口服毒性更大,酯溶性青蒿素类药物比水溶性类药物的毒性大,但这与青蒿素及其衍生物的药效无关。前文提及青蒿素机制,存在选择性抗肿瘤作用,而对正常组织作用较小。因此,我们认为青蒿素及其衍生物具有低毒和较高的安全性。具有成为临床化疗药物的潜在价值。本实验以此为依据,选择青蒿素衍生物中作用效果更强的DHA,研究其在不同浓度、不同时间下观察其对U87细胞的增殖、凋亡的影响,并对细胞凋亡的机制进行了初步探讨。目的探讨双氢青蒿素(DHA)对人恶性胶质母细胞瘤(U87)增殖和凋亡的影响。方法体外培养的U87细胞,加入不同浓度的DHA(10pmol/L、25μmol/L50μmol/L、100μmol/L.125μmol/L)分别经行培养24h、48h和72h；倒置显微镜下观察细胞的形态变化,CCK8药敏实验检测细胞增殖情况；流式细胞分析细胞周期变化；Hoechst33258染色观察细胞凋亡；Caspse-3舌性检测及细胞内活性氧(ROS)检测。DHA对U87细胞增殖的影响,不同浓度与不同时间的统计分析,采用单因素方差分析(Univaraiate-ANOVA);两两比较方差齐时采用LSD法,方差不齐时选用Dunnett’s T3法；对两组caspase-3蛋白表达统计分析,采用两独立样本t-test。结果DHA对U87细胞具有浓度和时间依赖性抑制细胞增殖作用。作用24h后ICso是97.04μmol/L,48h是59.76μmol/L,72h是33.20μmol/L。选择97.04μmol/L的DHA作用细胞24h后,细胞内的Caspse-3表达量增高(p<0.01),细胞内ROS含量也增高。讨论本研究显示DHA在体外对U87细胞有明显的增殖抑制作用,且随着药物浓度的升高和作用时间的延长,DHA的作用逐渐增强。利用流式细胞技术对U87细胞进行周期检测,发现DHA作用24h后的U87细胞数量与对照组比较明显减少,且细胞多被阻滞于G0-G1期,于S期的U87细胞较对照组明显减少。这说明DHA抑制U87细胞增殖的机制之一,是U87细胞阻滞在G0-G1期。因此,我们认为细胞周期调控是DHA抑制胶质瘤细胞增殖的机制之一。细胞凋亡是由多种基因调控的细胞程序性死亡过程,和一系列细胞内蛋白水解酶的活化有关。Caspase是一个在细胞凋亡过程中起重要作用的蛋白酶家族。Caspase活化是导致细胞凋亡的中心环节,而Caspase-3是细胞凋亡级联反应中最关键性的效应蛋白酶之一。在调亡细胞中Caspase-3含量增多。本研究结果发现,在使用DHA处理24小时后的U87细胞中,Caspase-3含量较对照组显著增多,表明DHA诱导U87细胞凋亡与激活caspase通路有关,其诱导胶质瘤细胞凋亡可能是通过caspase-3途径来实现的。另外本研究还发现,在使用DHA处理24小时后的U87细胞内ROS含量较对照组亦明显增多。这也可能是DHA抗肿瘤的作用机制之一。肿瘤细胞与正常的细胞相比具有快速分裂的特点,而快速分裂的肿瘤细胞在复制DNA的时候需要大量的铁,因此肿瘤细胞内含铁量比正常细胞高。而青蒿素及其类似物含有一个过氧化物桥结构,它能和亚铁离子反应形成大量活性氧自由基(ROS)。这些自由基在细胞内大量形成,对细胞产生毒性作用,引起细胞死亡。由于肿瘤细胞需要大量铁离子,其细胞表面分布的铁蛋白受体(TfR)亦远远多于正常细胞。因此,我们认为青蒿素及其类衍生物亦能对胶质瘤细胞产生选择性细胞毒作用,而对正常脑细胞作用较小。青蒿素在治疗胶质瘤时,安全性具有较高,具有进一步深入研究的价值。结论DHA对U87细胞具有抑制增殖作用,并诱导其凋亡,其凋亡机制可能和DHA改变细胞周期,激活caspase-3通路以及增加细胞内ROS含量有关。