申嗪霉素是假单胞菌产生的一种次级代谢产物,化学名称为吩嗪-1-羧酸(phenazine-1-carboxylic acid,简称PCA),能有效防治一系列重要农作物病害,如水稻纹枯病、瓜类蔓枯病和甜椒疫病等,具有高效、安全和对环境友好等特点。目前,主要通过微生物发酵的方法生产申嗪霉素。由于现有工程菌株申嗪霉素发酵效价偏低,导致其生产和使用成本较高。因此,有必要开展基础与应用研究,提高合成效率,促进申嗪霉素在生产中的推广与应用。假单胞菌PA1201具有两个高度同源的申嗪霉素合成基因簇,其中phzC基因的生物学功能还不清楚。本研究发现PhzC蛋白属于II型3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(DAHP)合成酶。敲除phzC基因显著降低申嗪霉素产量,过表达phzC基因明显提高申嗪霉素产量。PhzC蛋白包含有两个DAHP合成酶结构域。过表达PhzC蛋白的C-末端结构域,申嗪霉素产量增加38%;过表达N-末端结构域对PCA产量没有影响。点突变分析发现7个潜在的活性位点和1个保守的氨基酸残基对PhzC蛋白的酶活性是必需的。另外,DAHP合成酶缺陷突变株在回补pBBR-phzC后,可以恢复菌株生长,且外源添加不同浓度申嗪霉素后不影响菌株生长。这些结果表明PhzC蛋白是DAHP合成酶,其酶活性不受申嗪霉素的反馈抑制。本研究对假单胞菌PA1201的申嗪霉素合成途径及次级代谢途径进行了系统地遗传和代谢改造,所得工程菌株PA-IV的申嗪霉素产量是野生型菌株的56倍。以“开源节流”的原则对PA1201基因组进行改造,所采用的策略如下:(1)敲除吩嗪修饰基因phzM、phzS和phzH,阻断申嗪霉素转化;(2)置换aroG基因的启动子和单拷贝插入phzC基因,提高菌株的DAHP合成酶活性,使得更多的碳源流向莽草酸途径;(3)敲除或抑制其它分支酸利用途径,使得更多的分支酸流向申嗪霉素合成途径;(4)敲除5’-UTR和启动子置换,提高申嗪霉素合成基因簇phz1和phz2的表达;(5)用高活性启动子置换外排泵MexGHI-OpmD基因簇的启动子,加速申嗪霉素外排至细胞外;(6)叠加敲除21个非必需的次级代谢生物合成基因簇,减少细胞内冗余的代谢。工程菌株PA-IV进一步通过分批补料发酵后,申嗪霉素产量达到9882 mg/L。假单胞菌M18是目前申嗪霉素工业化生产菌株,其基因组全长为6327754-bp。本研究首先敲除M18基因组中的限制性修饰系统和CRISPR细菌免疫系统,显著提高了菌株的遗传转化效率,为后续遗传改造和基因组删减奠定了基础。其次,将5个菌株特异性基因组岛、2个前噬菌体和20个次级代谢生物合成基因簇系统敲除,减少了细胞内冗余的代谢和调控。最后,利用链特异性转录组测序技术,分析比较了M18全基因表达谱,结合必需基因数据,鉴定了22个低转录或不转录区域。叠加敲除其中13个大片段区域,最终获得基因组简化菌株MDS44,其基因组减少了740306-bp(占整个基因组的11.7%)。简化菌株MDS44的生长比野生型菌株略好,申嗪霉素产量是野生型菌株的5.45倍,转化效率显著提高,其它特性正在评估之中。本研究获得的申嗪霉素高产菌株PA-IV将能显著降低申嗪霉素的生产成本,促进其推广应用。基因组简化菌株MDS44具有良好的特性,为构建优势小基因组细胞工厂奠定了基础。