四翅滨藜胆碱单氧化酶基因AcCMO的克隆与功能验证

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植物在整个生长季节中,会受到各种不利环境的影响,使植物生长缓慢甚至停止生长,最终导致作物产量降低。其中,干旱、盐、营养失衡(包括矿物质中毒和矿物质缺乏)和极端温度是影响全世界作物产量的主要限制因素。据估计,全世界只有约10%的可耕地能够免遭不利环境的胁迫,其中干旱和盐胁迫成为发生面最广的两种不利环境。目前,全世界遭受盐害的土地有3×106km2以上,大约占全球陆地面积的6%。甘氨酸甜菜碱(Glycine betaine,简称GB)是一种中性的化合物,在很大的pH范围内它都是电中性的。研究表明,GB在体外不仅仅是没有毒害作用的渗透调节剂,而且当细胞受到逆境胁迫时,它还能促使植物细胞内渗透调节物质的形成。目前已经证实,GB在离体实验中能够起到稳定细胞结构、激活酶和蛋白质复合体的功能以及保持细胞膜的完整性,这些作用能帮助细胞免受高盐、高温和冻害的伤害。而CMO基因是GB合成中的关键酶。本文选用具有生物吸盐器之称的四翅滨藜做为材料,用NCBI上相近物种的CMO序列进行比对,设计简并引物进行扩增。以冷冻处理之后的四翅滨藜叶片为材料,提取RNA,反转录之后进行PCR扩增,得到了四翅滨藜的AcCMO基因序列,其含有1317个碱基,编码438个氨基酸。将序列提交到Genebank,获得登录号JF776158。进化分析表明其与大洋洲滨藜(Atriplex nummularia)和戟叶滨藜(Atriplex prostrata)亲缘关系最近。为了揭示AcCMO基因的功能,首先将其转入大肠杆菌和酵母进行表达。在酵母细胞中,分别做了盐、碱、干旱、氧化、高温和低温的胁迫处理,结果发现AcCMO基因能提高酵母对盐、碱、干旱和低温逆境的耐受力,表明AcCMO基因与植物的抗盐、碱、干旱和低温有关,与甜菜碱能在多种逆境中发挥作用相符。为了进一步验证AcCMO基因在植物中的功能,将AcCMO基因重组质粒转入农杆菌,进而转化拟南芥,共获得2株转基因苗,为下一步在拟南芥中验证AcCMO基因的功能奠定了基础。
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