马立克氏病毒(Marek’s disease virus, MDV)是一个高度致癌的α-疱疹病毒,导致机体免疫抑制和T细胞淋巴瘤。尽管人们认识到马立克氏病(Marek’s disease, MD)潜伏感染和转化是疾病的关键阶段,但是,关于T淋巴细胞免疫和致病机理,目前仍不清楚。胸腺是T淋巴细胞分化和成熟的场所,MDV感染后引起胸腺萎缩并最终导致免疫抑制,因此胸腺可以作为理想的研究器官以探索MDV感染宿主的免疫和致病机理。MDV潜伏感染主要与CD4+T细胞有关,而且最终发展成为淋巴瘤的也是T细胞。因此,T细胞免疫在MDV感染宿主的免疫和致病过程发挥着关键作用。研究表明,Toll样受体3(Toll-like receptor3, TLR3)在抗病毒T细胞免疫以及肿瘤免疫中起主导作用,而且TLR3激活的T细胞免疫应答对抵抗疱疹病毒感染是必须。TLR3在MDV感染后亦发生显著改变,其变化可能涉及MDV诱导的T细胞免疫。最近关于：microRNA研究发现：microRNA-155涉及TLR3信号途径的调控。而MDV编码的致癌microRNA mdv1-mir-M4是一种microRNA-155类似物,其作用靶位点与gga-mir-155完全相同。MDV是否通过mdvl-miR-M4调控宿主TLR3信号,目前尚不清楚。本研究主要通过蛋白质组学、转录组学、生物信息学和microRNA研究方法,探索了MDV超强毒RB1B株感染鸡胸腺组织后不同致病阶段蛋白质组和转录组的差异变化,以及microRNA-155调控的TLR3信号在RB1B感染和复制中的作用,为解答RB1B感染宿主的免疫和致病机理提供了重要数据和线索。1.RB1B感染鸡胸腺蛋白质组表达变化本研究用MDV超强毒株RB1B感染SPF鸡,研究了感染鸡胸腺的蛋白质组学变化。研究证明RBIB感染SPF鸡后,胸腺组织在感染后第21天、28天和35天呈现严重萎缩,在第42天逐渐恢复正常。以胸腺/体重为参数进行统计学分析结果表明,攻毒组在第7天、21天、28天和35天差异显著(P<0.05)。在胸腺组织蛋白样品制备、水化、等电聚焦、平衡等条件的摸索并建立鸡胸腺蛋白质组学方法测定的基础上,利用二维电泳和质谱分析技术共鉴定出119个差异表达的蛋白质,这些差异蛋白点主要集中在感染MDV后21、28和35天,与病理结果一致。GO注释结果显示：这些蛋白涉及到广泛的生物学过程,主要包括代谢、免疫、细胞凋亡和死亡、应激以及肿瘤等各个方面；其中,有七类蛋白共20个差异蛋白点(包括巨噬细胞游走抑制因子、热休克蛋白90等),与免疫、肿瘤发生、发展和转移等直接相关。Real-time PCR对这些主要差异蛋白进行了验证。对主要差异蛋白的功能以及相互作用关系进行了分析讨论,为进一步研究MDV-宿主相互作用提供了胸腺蛋白质组图谱,2. RB1B感染鸡胸腺病毒和宿主基因转录组表达变化本研究利用Affymetrix GeneChip Chicken Genome Arrays(包含32773个鸡转录物和684个病毒转录物)对MDV超强毒RB1B感染鸡胸腺进行了全基因组芯片分析。研究结果表明,在RB1B感染后第7、14、21和28天的鸡胸腺有86个病毒差异表达基因。在感染后第7天,检测到47个主要涉及病毒复制和免疫逃避的病毒基因。大多数病毒基因的表达在第21和28天增加,而在14天减少。与其他组织不同的是,我们发现在鸡胸腺组织中,病毒潜伏感染期建立时间在第14天。该研究结果提供了马立克氏病毒在鸡胸腺组织中的动态表达规律。鸡胸腺对MDV反应的转录组学分析结果表明,不同感染期共有594个与免疫、肿瘤、细胞周期与凋亡相关的差异基因,这些差异基因涉及到22条信号通路。GO分析显示在第7天上调表达的基因涉及免疫和炎症应答,而在第21和28天上调表达的基因涉及血管发生、细胞骨架重排、细胞粘附、信号转导。GAzer分析显示上调的生物学过程包括细胞增殖、细胞基质粘附、血管发生、免疫和炎症应答,其他生物学过程包括凋亡、细胞周期、有丝分裂、DNA复制、信使RNA加工、蛋白折叠、修饰和转运等发生下调。Pathway分析发现：与免疫、细胞周期与凋亡途径下调,而与肿瘤相关的信号途径上调。本研究结果提供了病毒感染对宿主基因表达的差异表达图谱,为进一步解释马立克氏病毒发病机制和致癌机理提供了线索。3.TLR3特异性应答识别RB1B感染和复制MDV感染主要引起T细胞免疫抑制,而Toll样受体在抗病毒T细胞免疫应答中发挥着重要作用。然而,目前并不清楚MDV引起的特异性T细胞免疫应答是否与Toll样受体介导的免疫相关。本研究利用MDV超强毒株RB1B感染SPF鸡,检测了不同时间宿主的TLR和CD4、CD8分子的转录水平变化。研究发现,在RB1B感染后第7天、14天、21天和28天的鸡胸腺组织中,有28个与Toll受体介导的免疫以及MHC介导的免疫相关的基因呈现显著变化；其中24个与免疫相关的基因在感染后第7天显著上调,然而,其中大多数基因在第21和28天下调；CD4和CD8分子表达与TLR3信号呈正相关,均显著下调。该结果揭示了MDV可能通过TLR3信号影响了MDV特异性T细胞免疫应答。为了进一步了解RB1B感染细胞对TLR3影响,我们利用MDV RB1B感染CEF细胞,检测TLR3基因表达变化；研究发现,RB1B感染CEF后96小时,TLR3表达极显著上调,高达40多倍。而TLR2、TLR4、TLR7、TLR15和TLR21基因表达没有出现显著改变,提示RB1B病毒对TLR3基因表达有着特异性调控。以TLR3配体ploy (I:C)激活TLR3信号后,检测病毒基因(gB和Meq)表达、病毒饰斑形成单位(PFU)等的结果进一步证实RB1B的感染和复制被显著抑制。通过RNA干扰抑制TLR3信号发现,干扰TLR3后可以显著促进RB1B的感染和复制。然而,其他TLR配体(LPS, Imiquimod口CpG)处理或TLR2/4抑制剂和MyD88抑制剂处理对RB1B感染和复制并无显著影响。研究结果证明,对TLR3信号的调控可以显著影响RB1B病毒的感染和复制。4. TLR3是RB1B编码的mdv1-miR-M4-5p靶基因TLR3激活产生的免疫应答与MDV感染和致病密切相关；因此,了解TLR3表达调控机制将有助于对病毒的控制和治疗。本研究通过生物学信息学方法发现在鸡TLR3基因(NCBI编号为NM001011691)编码区存在mdv1-miR-M4-5p和gga-miR-155和种子序列AGCATTA(位于第967-973位核苷酸)。根据这一理论基础,将鸡TLR3基因编码区构建至荧光素酶报告基因质粒pGV-272产生重组质粒pGV-272-TLR3-ORF-WT。同时,将鸡TLR3基因编码区第968-972位核苷酸GCATT突变为CGTAA构建产生pGV-272-TLR3-ORF-MU。另外,分别将gga-mir-155和mdv1-mir-M4-5p前体序列构建至pGV-268产生pGV-268-mdv-mir-M4-5p和pGV-268-gga-mir-155。然后,将质粒共转染到HEK293T细胞中,48小时后收集细胞检测荧光素酶活性,结果发现：gga-miR-155和mdv1-miR-M4显著下调pGV-272-TLR3-ORF-WT荧光素酶活性,而对照组mir-NC对此无显著改变；在反向实验中,无论是gga-miR-155和mdv1-mir-M4还是对照组mir-NC均未能改变pGV-272-TLR3-ORF-MU荧光素酶活性。这表明TLR3mdvl-miR-M4-5p和gga-miR-155的靶基因,后者可以直接与TLR3编码区第967-973位核苷酸结合。Vest-blot结果进一步证明外源性mdv1-miR-M4-5p和gga-miR-155mimic显著抑制TLR3基因表达。本研究证明mdv1-miR-M4-5p和gga-miR-155mimic直接作用于TLR3编码区抑制TLR3表达；实验结果进一步证实了microRNA通过作用于基因编码区发挥作用,特别是首次证实MDV编码的microRNA可以直接作用于宿主基因编码区发挥调控功能,这极大地丰富了microRNA调控理论。5. MicroRNA-155调控的TLR3信号介导RBlB感染和复制MDV编码致癌microRNA-155类似物ndv1-miR-M4,其调控机制尚不清楚。本研究发现RB1B感染CEF后mdv1-miR-M4-5p并不与病毒基因(gB和Meq)表达一致,而是与TLR3的表达趋势一致,这暗示mdv1-miR-M4-5p的表达对TLR3表达可能存在特定调控作用。分别用50nM、100nM和200nM mdv1-miR-M4-5p mimic转染CEF,结果显示：与对照组NC mimic相比,TLR3基因表达显著减少,并且IFN-β的释放被显著抑制。然后,我们观察到通过外源性gga-miR-155mimic转染CEF显著降低TLR3表达,而通过TLR配体刺激HD11细胞产生的内源性gga-miR-155与TLR3表达之间存在负调控关系；而且,TLR3配体激活TLR3产生的信号如IFN-p可以诱导gga-miR-155产生。最后,通过mdv1-miR-M4-5p和gga-miR-155mimic转染实验观察到二者过表达促进RB1B感染和复制,反之,抑制RB1B感染和复制。本研究结果证明,microRNA-155调控的TLR3信号可以介导RB1B感染和复制,而这种机制被RB1B编码的类似物mdv1-miR-M4-5p所利用。