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背景：本实验室前期研究发现，在小鼠下丘脑来源的GT1-7细胞中过表达miR-505-3p，能抑制GPR54，Kiss1 等性发育相关基因的表达，同时也证明SRSF1是miR-505-3p的靶基因[1]。SRSF1最初作为mRNA剪接因子被发现，是剪接调节剂SR蛋白家族的重要成员，除了能调控自身转录本的剪接以外，还调节影响细胞信号通路、增殖和细胞周期进程的多种基因mRNA的选择性剪接[2]。通过对本实验室构建的SRSF1敲低的GT1-7细胞（D09）的转录组测序数据分析，发现另一种RNA结合蛋白LIN28A和LIN28B的差异表达， Real-Time PCR检测结果与测序结果一致。LIN28被证明参与了小鼠的性发育调控[3]，但是具体作用机制有待研究。
目的：在GT1-7细胞中，构建SRSF1转录本001与EGFP共表达的报告系统，以对影响其剪接的外部和内部因素进行更高效筛选和研究；在GT1-7细胞中过表达LIN28A和LIN28B，以研究其与性发育相关基因表达是否存在调控关系；并且通过转录组测序发现LIN28A和LIN28B参与调控性发育的信号通路及相关基因，为解析LIN28调控性发育的机制提供理论基础。
方法：利用CRISPR/Cas9基因编辑技术和同源重组的方法，在GT1-7细胞中构建内源性的SRSF1转录本001的高灵敏度的报告系统。通过流式细胞术检测绿色荧光强度进行对阳性克隆的筛选。
构建LIN28A和LIN28B的慢病毒过表达载体，转染293-T细胞检测载体的有效性。之后在GT1-7细胞用Real-Time PCR检测过表达效率，并检测性发育相关基因在mRNA水平的表达变化，确定与性发育相关基因之间的具体联系。将过表达LIN28A和LIN28B的GT1-7细胞进行转录组测序，及生物信息学分析，并用Real-Time PCR验证，找到影响性发育的信号通路，初步探索LIN28A和LIN28B与其他性发育相关基因之间的分子机制。
结果：流式细胞术检测到，转染SRSF1-001报告系统的GT1-7细胞和Cas9-GT1-7细胞中均含有绿色荧光，说明报告系统成功构建。此外，Cas9-GT1-7细胞相对GT1-7细胞检测到更多含有绿色荧光的单克隆，说明Cas9-GT1-7细胞会增加SRSF1-001报告系统的构建效率。但是由于内源性报告系统的构建效率较低，以及流式细胞分选仪等实验仪器的限制，最终未能筛选到含有报告系统的单克隆。
将构建的LIN28A和LIN28B慢病毒过表达载体，转染293-T细胞，荧光显微镜观察到较强的绿色荧光，说明载体有效。Real-time PCR确定LIN28A和LIN28B在GT1-7细胞中过表达，LIN28A过表达18倍，LIN28B过表达2.3倍。在LIN28A过表达的GT1-7细胞中，KISS1表达量显著性上升（p<0.01），在LIN28B过表达的GT1-7细胞中， KISS1表达量显著性下调（P<0.05），说明LIN28A和LIN28B均影 响了性发育相关基因的表达。
转录组测序结果显示，LIN28A过表达的GT1-7细胞中检测到536个具有显著差异的基因，LIN28B检测到221个。LIN28A的差异基因表达产物大多位于细胞质，具有蛋白质和RNA的结合功能。LIN28B的差异基因大多数具有蛋白质结合功能。KEGG 分析， LIN28A相关的差异基因在MAPK信号通路差异显著。MAPK通路中筛选到的性发育相关基因Fgf21的表达量相比于对照组显著降低（P<0.05），JUN的表达量显著降低（P<0.01），Cyp1a1的表达量显著升高（P<0.05），Rasgrp2的表达量显著降低（P<0.01）。有研究发现Fgf21过表达会导致雌性小鼠的不育[4]。另外，在机制上，Fgf21作用于下丘脑的视交叉上核（SCN）以抑制血管加压素 - Kisspeptin信号级联反应，从而抑制促黄体激素的发情前期激增[5]，说明LIN28A可能通过下调Fgf21来调控KISS1等性发育相关基因与性发育进程。
LIN28B对PI3K-Akt 信号通路有显著影响。该通路性发育相关基因pdgfc的表达量相比于对照组显著升高（P<0.01），PRLR的表达量相比于对照组显著升高（P<0.05），Itgb4的表达量相比于对照组显著降低（P<0.001）。有研究显示高水平的催乳素受体（PRLR）会导致不育，在卵巢切除大鼠的弓状核中，大多数含Kiss1 mRNA的细胞也共表达PRLR mRNA [6]。所以LIN28B可能通过对PRLR的调控进而调控KISS1，以此来调控性发育。最后通过Real-time PCR验证。综上所述，我们推测LIN28A可能通过MAPK信号通路，LIN28B 可能通过PI3K-Akt 信号通路发挥性发育调控功能。为后续更深入的解析LIN28A和LIN28B影响性发育的分子机制研究提供一个研究基础。
目的：在GT1-7细胞中，构建SRSF1转录本001与EGFP共表达的报告系统，以对影响其剪接的外部和内部因素进行更高效筛选和研究；在GT1-7细胞中过表达LIN28A和LIN28B，以研究其与性发育相关基因表达是否存在调控关系；并且通过转录组测序发现LIN28A和LIN28B参与调控性发育的信号通路及相关基因，为解析LIN28调控性发育的机制提供理论基础。
方法：利用CRISPR/Cas9基因编辑技术和同源重组的方法，在GT1-7细胞中构建内源性的SRSF1转录本001的高灵敏度的报告系统。通过流式细胞术检测绿色荧光强度进行对阳性克隆的筛选。
构建LIN28A和LIN28B的慢病毒过表达载体，转染293-T细胞检测载体的有效性。之后在GT1-7细胞用Real-Time PCR检测过表达效率，并检测性发育相关基因在mRNA水平的表达变化，确定与性发育相关基因之间的具体联系。将过表达LIN28A和LIN28B的GT1-7细胞进行转录组测序，及生物信息学分析，并用Real-Time PCR验证，找到影响性发育的信号通路，初步探索LIN28A和LIN28B与其他性发育相关基因之间的分子机制。
结果：流式细胞术检测到，转染SRSF1-001报告系统的GT1-7细胞和Cas9-GT1-7细胞中均含有绿色荧光，说明报告系统成功构建。此外，Cas9-GT1-7细胞相对GT1-7细胞检测到更多含有绿色荧光的单克隆，说明Cas9-GT1-7细胞会增加SRSF1-001报告系统的构建效率。但是由于内源性报告系统的构建效率较低，以及流式细胞分选仪等实验仪器的限制，最终未能筛选到含有报告系统的单克隆。
将构建的LIN28A和LIN28B慢病毒过表达载体，转染293-T细胞，荧光显微镜观察到较强的绿色荧光，说明载体有效。Real-time PCR确定LIN28A和LIN28B在GT1-7细胞中过表达，LIN28A过表达18倍，LIN28B过表达2.3倍。在LIN28A过表达的GT1-7细胞中，KISS1表达量显著性上升（p<0.01），在LIN28B过表达的GT1-7细胞中， KISS1表达量显著性下调（P<0.05），说明LIN28A和LIN28B均影 响了性发育相关基因的表达。
转录组测序结果显示，LIN28A过表达的GT1-7细胞中检测到536个具有显著差异的基因，LIN28B检测到221个。LIN28A的差异基因表达产物大多位于细胞质，具有蛋白质和RNA的结合功能。LIN28B的差异基因大多数具有蛋白质结合功能。KEGG 分析， LIN28A相关的差异基因在MAPK信号通路差异显著。MAPK通路中筛选到的性发育相关基因Fgf21的表达量相比于对照组显著降低（P<0.05），JUN的表达量显著降低（P<0.01），Cyp1a1的表达量显著升高（P<0.05），Rasgrp2的表达量显著降低（P<0.01）。有研究发现Fgf21过表达会导致雌性小鼠的不育[4]。另外，在机制上，Fgf21作用于下丘脑的视交叉上核（SCN）以抑制血管加压素 - Kisspeptin信号级联反应，从而抑制促黄体激素的发情前期激增[5]，说明LIN28A可能通过下调Fgf21来调控KISS1等性发育相关基因与性发育进程。
LIN28B对PI3K-Akt 信号通路有显著影响。该通路性发育相关基因pdgfc的表达量相比于对照组显著升高（P<0.01），PRLR的表达量相比于对照组显著升高（P<0.05），Itgb4的表达量相比于对照组显著降低（P<0.001）。有研究显示高水平的催乳素受体（PRLR）会导致不育，在卵巢切除大鼠的弓状核中，大多数含Kiss1 mRNA的细胞也共表达PRLR mRNA [6]。所以LIN28B可能通过对PRLR的调控进而调控KISS1，以此来调控性发育。最后通过Real-time PCR验证。综上所述，我们推测LIN28A可能通过MAPK信号通路，LIN28B 可能通过PI3K-Akt 信号通路发挥性发育调控功能。为后续更深入的解析LIN28A和LIN28B影响性发育的分子机制研究提供一个研究基础。